急诊局部注射肝细胞生长因子预防喉外伤声带瘢痕形成.docVIP

急诊局部注射肝细胞生长因子预防喉外伤声带瘢痕形成 　　在现代快节奏社会中，耳鼻咽喉外伤逐渐增多[1-3]，喉外伤随着交通工具的进步也明显增加。喉外伤导致喉黏膜撕裂缺损，创伤部位的声带黏膜层在愈合过程中被瘢痕组织取代，发声时无法产生正常的振动，导致患者的嗓音质量严重受损，严重的将导致喉腔的粘连、呼吸困难。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）能通过促进上皮细胞增殖、抑制上皮细胞凋亡及促进胶原降解、抑制胶原合成，是少数能阻止纤维化的生长因子之一。HGF在抑制肝、肾、心、肺等多种器官的纤维化和结构重建方面起重要作用[4]。笔者在兔动物模型上进行了HGF预防喉外伤后瘢痕形成的探索，现报道如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 实验动物及分组 新西兰白兔30只（上海医科院，清洁级），雌雄不拘，体质量2.5～3.0 kg，采用随机数字表法分为2组，治疗组15只，对照组15只。 　　1.1.2 主要试剂 HGF（购自Sigma，美国），透明质酸（hyaluronic acid ， HA）酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA）试剂盒（Rapid Bio Lab，美国），小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）单克隆抗体（Santa Cruz，美国）。 　　1.1.3 主要仪器及设备 小号支撑喉镜（Karl Storz GmbH，德国），手术显微镜（S-21，Carl Zeiss，德国），喉刀。 　　1.2 模型喉外伤的兔动物模型的建立[5-6]。手术操作均由同一人完成。 　　1.2.1 治疗组 新西兰兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠1 ml/kg行静脉麻醉后，固定于手术台上，以支撑喉镜暴露声门。用微型喉刀机械切划声带黏膜，造成声带黏膜机械性损伤后，立即用注射器将HGF（100 ng HGF溶于100 μl生理盐水中）注射于声门旁疏松结缔组织。左右侧均同法处理。 　　1.2.2 对照组 声带黏膜损伤方法同治疗组，术后立即在声门旁疏松结缔组织中注射生理盐水。左右侧均同法处理。 　　1.3 术后检测 　　1.3.1 HE染色 术后1周，分别在两组中随机（采用随机数字表法）抽取5只新西兰兔处死，将喉取出，每组可获得10份声带标本。从手术损伤部位切取1 mm×1 mm×1 mm的声带黏膜组织，于4% 甲醛中固定后，清水漂洗，石蜡包埋后切片，片厚4 μm，行苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察。 　　1.3.2 HA检测 术后1周，送上述每组10份声带标本中手术损伤部位切取0.1 g的声带黏膜组织（质量由电子天平称得）研磨成组织匀浆。用ELISA测定共计20份样本中的HA含量。测定具体步骤按试剂盒说明书进行，在酶标仪上读取吸光度（A）值，通过标准曲线换算成相应质量浓度，结果以pg/mg表示。 　　1.3.3 上皮细胞增殖强度检测 术后1个月，分别在两组中随机（采用随机数字表法）抽取5只新西兰兔处死，同法取得每组10份的声带黏膜组织，切片后采用免疫组化法检测声带黏膜上皮中的PCNA表达。具体步骤：组织石蜡切片，厚4 μm，60 ℃恒温箱内烤片1 h。二甲苯脱蜡和水化，酒精梯度脱二甲苯，蒸馏水清洗。微波法修复抗原，置于3% H2O2 溶液中室温下孵育30 min，以去除内源性过氧化物酶活性。PBS液洗，滴加正常血清封闭液，37 ℃孵育10 min。滴加一抗PCNA抗体，4 ℃过夜，PBS清洗。滴加二抗（生物素化羊抗鼠抗体），37 ℃孵育20 min，PBS清洗。加链霉菌生物素――过氧化物酶溶液，37 ℃孵育20 min，PBS清洗。DAB显色剂显色，苏木素复染，片烤干，封片，光镜下观察。免疫组化检测结果的观察及判断细胞计数：以细胞核呈弥漫棕黄色细小颗粒为阳性细胞，每张切片上皮层随机取8幅视野，采用全自动图像分析仪对阳性细胞进行计数，在400倍显微镜下记录每视野（10814 μm2）中的阳性细胞数。 　　1.3.4 胶原纤维沉积量的检测 术后6月，将每组最后5只新西兰兔处死，同法取得每组10份的声带标本，切片后采用Masson三色法检测声带黏膜下间质中的胶原纤维沉积情况。具体步骤：10%甲醛液固定组织，石蜡切片，苏木素染液5～10 min，1%盐酸分化，流水冲洗数分钟，Masson复合染色液5～10 min，1%磷钨酸液处理约5 min，亮绿染色液（或苯胺蓝液）复染5 min，1%冰醋酸水处理1 min，95%酒精、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。 　　1.3.5 统计学方法 检测数据采用SPSS 12.0统计软件进行处理，计量资料用均