加味小苦辛汤对博来霉素A5致肺纤维化小鼠肺组织形态及转化生长因子β1的影响.docVIP

加味小苦辛汤对博来霉素A5致肺纤维化小鼠肺组织形态及转化生长因子β1的影响 　　摘要：目的 探讨加味小苦辛汤对博来霉素A5（BLM A5）所致肺纤维化动小鼠组织形态及转化生长因子-β1（TGF-β1）表达的影响。方法 小鼠腹腔注射BLM A5造模。随机分为正常对照组、模型组、西药组及加味小苦辛汤高、中、低剂量组（中药高、中、低剂量组）。各药物组于造模次日起每日连续给予相应药物，正常对照组与模型组给予羧甲基纤维素灌胃，于给药第14、28日分批随机处死小鼠，观察各组病理切片肺组织形态学改变，免疫组化方法观察肺组织TGF-β1阳性细胞积分光密度和平均光密度。结果 模型组较正常对照组细胞积分光密度、平均光密度均显著增加（P0.05），第28日较西药组降低（P0.05），且2组较正常对照组增加亦不显著（P0.05）。结论 加味小苦辛汤可显著降低肺纤维化小鼠的肺泡炎程度与肺纤维化程度，降低肺组织细胞TGF-β1的表达。 　　关键词：肺纤维化；加味小苦辛汤；博来霉素A5；转化生长因子-β1；小鼠 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.05.013 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）05-0035-03 　　特发性肺纤维化是指原因不明的弥漫性进行性肺间质纤维化，是多种原因所致的慢性间质性肺炎终末阶段[1]。有研究表明，转化生长因子-β（TGF-β）是已知最强的致纤维化细胞因子，在肺纤维化发生的细胞因子中占据着重要地位，对肺纤维化的发生发展至关重要[2]。本研究采用博来霉素A5 （bleomycin A5，BLM A5）建立小鼠肺纤维化模型，观察加味小苦 　　基金项目：北京中医药大学自主选题项目（2011JYB22XS-002） 　　通讯作者：徐荣谦，E-mail：xurongqian1950@163.com 　　辛汤对肺纤维化小鼠肺组织病理形态及TGF-β1的影响，探讨其对肺纤维化小鼠的治疗作用及可能的作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物 　　雌性C57BL/6小鼠，72只，体质量14～20 g，北京维通利华实验动物有限公司提供，合格证号：0251699。饲养于清洁级标准环境中，实验期间小鼠自由饮水进食。 　　1.2 药物与试剂 　　BLM A5，日本化药株式会社制造（批号410102，进口药注册证号：。加味小苦辛汤由黄芩、黄连、干姜、半夏、桂枝等组成，北京康仁堂药业有限公司制作成免煎颗粒，每1 g相当于原药材量10 g。醋酸泼尼松片，河南天方药业股份有限公司生产（批号110630550）。兔TGF-β1（sc-146）、SP-9001免疫组化试剂盒、生物素化山羊抗兔IgG、辣根酶标记链霉卵白素（S-A/HRP）、DAB显色试剂盒（zli-9032），均由北京中杉生物技术有限公司提供。 　　1.3 造模、分组与给药 　　将72只小鼠随机分为正常对照组、模型组、西药组及加味小苦辛汤方高、中、低剂量组（4.6、2.3、1.15 g/kg），每组12 只。除正常对照组小鼠外，其余组小鼠均按照文献[3]方法，分别于实验第0、2、4、6、8日于腹膜腔注射BLM A5（40 mg/kg） 200 ?L×5次，复制肺纤维化小鼠模型。正常对照组以生理盐水代替BLM A5。 　　于造模成功后第2日开始灌胃给药，给药剂量参照人每日常规剂量进行换算。正常对照组和模型组用羧甲基纤维素10 mL/kg灌胃，西药组用醋酸泼尼松龙5 mg/（kg?d）灌胃，中药各组分别给予加味小苦辛汤颗粒剂46 g/（kg?d），每日1次。 　　1.4 标本采集 　　于给药后第14、28日分批处死小鼠，每次每组6只。开胸分离出双肺，取右肺置于4%甲醛溶液中固定，常规石蜡切片。 　　1.5 组织病理学观察 　　根据Szapiel等[4]的方法确定肺泡炎和肺纤维化的程度。利用HE染色的病理切片将肺泡炎分为4级：无肺泡炎（-）；轻度肺泡炎（+）：肺泡隔因细胞浸润增宽，病变范围局限在全肺的20%以下；中度肺泡炎（++）：病变范围占全肺的20%～50%；重度肺泡炎（+++）：呈弥漫性分布，病变范围50%。利用Masson三色染色的切片将肺间质纤维化分为4级：无纤维化（-）；轻度纤维化（+）：受累范围小于20%；中度纤维化（++）：受累范围占全肺的20%～50%，肺泡结构紊乱；重度肺纤维化（+++）：受累范围大于50%，肺泡融合，肺实质结构紊乱。 　　1.6 肺组织中转化生长因子-β1测定 　　将石蜡肺组织切片常规脱蜡、进水，0.03%过氧化氢孵育10 min，蒸馏水冲洗2 min×3次，TBS洗5 min；将切片放入盛有枸橼酸盐缓