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硝化应激对小鼠肝原代细胞损伤及机制研究 　　【摘要】目的：观察硝化应激重要硝化剂过氧亚硝基阴离子（ONOO-）对肝原代细胞的体外损伤作用及机制研究。方法：通过不同浓度ONOO-供体SIN-1作用于肝原代细胞24h，探索SIN-1的有效作用剂量，同时加入ONOO-清除剂FeTMPyP处理确认是否是ONOO-对肝原代细胞产生影响。将肝原代细胞分为Control组，SIN-1作用组和ONOO-清除剂组，用MTT法分别检测各组肝细胞存活率，LDH检测细胞坏死情况，Western Blot法检测细胞内ONOO-生成印记蛋白――3-硝基酪氨酸（3-NT或NT）表达情况。结果：200μM的SIN-1刺激24h使肝细胞存活率明显下降，同时检测该浓度下的肝细胞培养基中LDH的活性发现也明显升高。WB结果显示SIN-1组细胞NT蛋白表达明显升高。结论：ONOO-能够介导肝细胞硝化应激，造成原代肝细胞的损伤。 　　【关键词】硝化应激；肝原代细胞；过氧亚硝基阴离子 　　【中图分类号】R453【文献标识码】A【文章编号】1004-4949（2013）12-221-02 　　硝化应激（NitrativeStress）[1]指机体内活性氧簇与活性氮簇共同生成增加时导致机体内产生大量的硝化能力极强的一类硝化物质，如过氧亚硝基阴离子等等，进而对机体内的一些蛋白质产生硝化作用或者对细胞的核酸物质产生硝化作用，进而引起一些的机体的病理变化。研究发现，病理情况下，在体内产生过量的超氧阴离子等氧化物质的同时体内体内诱导型一氧化氮合酶表达及活性增加，催化产生大量NO；NO与氧化应激反应的产物超氧阴离子（O2-）结合后产生过氧亚硝基阴离子（Peroxynitrite，ONOO-）等硝化能力很强的物质，从而使机体产生硝化应激[2]，体内多种途径可导致蛋白质酪氨酸残基的硝化，其中经由过量NO与.O2-反应生成的ONOO-介导的蛋白质硝化被认为是最主要的途径之一[3]，主要的是致使机体内一些蛋白质酪氨酸残基发生硝基化，生成硝基酪氨酸（nitrotyrosine，NT），而NT也被认为是硝化应激的印记蛋白。近年来研究表明，在一些肝脏疾病过程中或者病理情况下会导致肝脏发生硝化应激的现象[4]，而硝化应激也被认为参与了多种疾病如酒精性脂肪肝的病理生理过程中[5]。但是对于硝化应激是否对肝细胞产生直接的作用以及其作用的具体机制尚不完全清楚。本项研究采用ONOO-供体3-吗啉斯德酮亚胺（3-morpholinosydnonimine，SIN-1）体外直接作用于原代培养的小鼠肝原代细胞，观察ONOO-对肝原代细胞的直接作用，并探讨其作用的机制。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验动物： 　　8周龄健康雄性C57小鼠，由内蒙古医科大学动物部提供。 　　1.2 主要试剂及仪器： 　　主要试剂：William’s E培养基购自美国Gibco/BRL公司；胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone公司；噻唑蓝（MTT）和SIN-1均购自美国Sigma公司；0.05%胰酶-EDTA、购自美国Invitrogen公司；NT一抗购自美国abcame公司；5，10，15，20-四羟甲基（N-甲基-4‘-吡啶基）铁卟啉（FeTMPyP）购自美国Cayman Chemical公司；鼠尾胶原购自美国BD公司；LDH检测试剂盒购自南京建成公司。 　　主要仪器：德国Heraeus常温水平离心机，美国MD酶标仪，美国Bio-rad电泳仪。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1酶消化法取小鼠肝原代细胞，培养待用： 　　将肝细胞以每孔5×103个接种于96孔培养板，每孔加培养基100μl，待生长至单层融合后，低血清（0.5%FBS）处理12h后进行不同处理24h。细胞分组：空白对照组，SIN-1作用组（先采用0至500μMSIN-1刺激细胞，最终选取200μM作为刺激细胞的浓度），SIN-1+FeTMPyP（10μM）作用组，FeTMPyP（10μM）单独作用组。药物作用24h后每孔加入5mg/mL MTT溶液10μl，继续培养4h，弃去上清后每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），振荡5min使结晶物充分溶解，用酶标仪测定570nm波长各孔吸光度（OD）值。细胞存活率=处理组细胞OD值/正常对照组细胞OD值（药物浓度为0时的细胞存活率）×100%。 　　1.3.2 LDH检测试剂盒检测细胞培养基LDH活性： 　　取对照组，SIN-1作用组以及清除剂干预组细胞培养基检测其中LDH的活性。具体方法参照南京建成LDH活性测定试剂盒说明书。 　　1.3.3 Western Blot方法检测各组细胞NT的表达水平： 　　刮取各组处理的细胞用RIPA裂解液提取总蛋白。BCA法测定各组细胞