聚羟基脂肪酸酯产生菌的发酵优化.docVIP

聚羟基脂肪酸酯产生菌的发酵优化 　　【摘要】目的：探讨聚羟基脂肪酸酯产生菌的发酵优化方法。方法：将筛选出的PHB产量较高野生菌株Rhizobium sp.H2-5作为研究对象，对该菌株采用补料发酵及两步发酵的方法进行优化，分析PHB的产量、发酵液吸光值 OD660、菌体干重等优化结果。结果：菌体干重达到最大值1.473g/L后又逐渐降低；发酵液OD660至50h时始终升高后呈降低趋势，63h时PHA提取率达到最大60.93%；发酵液吸光值OD660、菌体干重、PHA提取率随着发酵时间的延长均先升高，菌体干重最大值为1.894g/L，PHA提取率最大为68.48%，随后随着发酵时间的延长而呈下降趋势。结论：补料发酵及两步发酵均可提高发酵菌体量，并可获得更高的PHA合成率。 　　【关键词】聚羟基脂肪酸酯；发酵优化；两步发酵 　　1、材料与方法 　　1.1材料及试剂 　　HZQ-F160数显全温振荡培养摇床（金坛市岸头中旺实验仪器厂）；DNP-9082电热恒温培养箱型（上海精宏试验设备有限公司）；YXQ-LS-50SⅡ全自动立式压力蒸汽灭菌器（上海帕特泵业制造有限公司）；Anke TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；DHZ-DA 全温摇床（江苏太仓市实验设备厂）。葡萄糖、蛋白胨、酵母膏（北京市奥博星生物技术有限公司）；氯化钠（天津市北方天医化学试剂厂）；琼脂（天津市科密欧化学试剂开发中心）等。 　　1.2方法 　　1.2.1补加氮源法 　　配制发酵培养基，碳氮比100/4，其中葡萄糖为碳源，蛋白为胨氮源，初始pH为7.0[1][2]，将菌株Rhizobium sp.H2-5 种子液按照4%的接种量接种至装液量为100mL/500mL的三角瓶中，在32℃，160r/min条件下摇床培养，至24h后得种子液[3]，补加氯化铵溶液，至氯化铵浓度达到0.125g/L为止。继续发酵，至67h结束，每4h取样一次，观察发酵液吸光值OD660、菌体干重、PHA提取率等变化情况。 　　1.2.2两步发酵法 　　培养条件与1.2.1中相同摇床培养36h后，测定种子液的吸光值OD660，并离心收集菌体，离心转速5000r/min，离心时间15min[4]，菌体经过发酵培养基两次洗涤后加入到装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，继续培养[5]。每8h取样一次，观察发酵液吸光值OD660、菌体干重、PHA提取率等变化情况。 　　2、结果 　　2.1补料发酵结果 　　补加氯化铵后，菌体干重不断升高至47h时达到最大1.473g/L后又逐渐降低；发酵液OD660至50h时始终升高后呈降低趋势，PHA提取率亦随时间的延长而升高，63h时PHA提取率达到最大60.93%。 　　2.2两步发酵结果 　　发酵液吸光值OD660、菌体干重、PHA提取率随着发酵时间的延长，均是先升高，在发酵时间为49h时，达到最大值，此时菌体干重为1.894g/L，PHA提取率为68.48%，随后随着发酵时间的延长而呈下降趋势。 　　3、讨论 　　从实验结果来看，补料加氮法和两步发酵法均可提高PHA提取率，是有效可行的发酵优化方法，且对菌株H2-5来说，两步发酵法优于补料加氮法发酵，这一结论与文献[6][7]中结论达为一致。 　　此外，本研究还针对培养基中葡萄糖浓度对PHA提取率的影响进行了分析比对，结果发现当葡萄糖浓度达到5g/L，其他条件相同的情况下PHA提取率最高[8]，因此本试验将葡萄糖的初始浓度定为5g/L，所以本试验将葡萄糖的初始浓度以及碳氮比分别设为5g/L再补加适量的氯化铵溶液，为菌体细胞提供氮源用于自身的生长繁殖[9][10]。 　　参考文献 　　[1] 朱博维，焦宁宁，等.聚羟基脂肪酸酯的合成和应用研究进展[J].现代塑料加工应用，2003，10（5）：62-63. 　　[2]Steinbuchel，A.and Lutke-Eversloh，T.，metabolic engineering and pathwayconstruction for biotechnical production of relavent polyhydroxyalkanotes in microoganisms， Biochemical engineering Journal， 15（2003）：81-96. 　　[3] 祁红兵，陈钧. PHB 高产菌株的选育[J].信阳师范学院学报：自然科学版，2007，20（ 1） ： 48-51. 　　[4] Amara， A. A. and Rehm， B. H. A. （2003） Replacement of the catalytic nucleophile Cys-2