应用16SrRNA基因序列分析快速鉴定临床标本中的革兰氏阳性杆菌.docVIP

应用16SrRNA基因序列分析快速鉴定临床标本中的革兰氏阳性杆菌 　　[摘要] 目的 探索一种快速鉴定临床标本中革兰氏阳性杆菌的方法。 方法 利用PCR技术扩增待检菌株的16 S rRNA基因序列，通过分析待检菌株的16 S rRNA基因序列对其进行鉴定。 结果 5株待检菌株的16 S rRNA基因序列均成功扩增，其中4株的16 S rRNA基因序列与基因库中已注册的核酸序列相似率达99.9%以上，将其鉴定到种的水平，1株的16 S rRNA基因序列与基因库中雷弗森菌属的核酸序列相似率为97.09%，将其鉴定为雷弗森菌属。 结论 应用16 S rRNA基因序列分析可快速、准确地鉴定临床标本中的革兰氏阳性杆菌。 　　[关键词] 16 S rRNA基因；细菌鉴定；革兰氏阳性杆菌 　　[中图分类号] R446.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）03（a）-0094-03 　　近年来，随着人口老龄化、免疫损害宿主增加等因素的影响，革兰氏阳性杆菌感染的发病率有升高趋势[1-3]。常见的革兰氏阳性致病杆菌有单核细胞增生性李斯特菌、棒状杆菌、红斑丹毒丝菌、诺卡菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌以及炭疽杆菌等。革兰氏阳性杆菌感染其表型特征的敏感性及特异性较差，通过常规检验手段对其进行快速、准确的鉴定比较困难。2012年3～10月，本研究从临床标本中相继分离出5株革兰氏阳性无芽胞杆菌。为了快速、准确地鉴定这些菌株，笔者利用PCR技术对其16 S rRNA基因进行扩增，然后通过16 S rRNA基因序列分析将其鉴定至属或种的水平。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株 5株革兰氏阳性杆菌均分离自北京武警总医院各科临床标本，菌株编号分别为QC0411、QC0823、Y0720、Z0802、20983。 　　1.1.2 试剂 Chelex-100树脂（伯乐公司，美国），琼脂糖G-10（Gene公司，美国），溴乙锭（Promega公司，美国），Ex Taq聚合酶试剂盒及DL2000 DNA Marker均购自宝生物工程大连有限公司。16 S rRNA基因的扩增选用16 S rRNA基因细菌通用引物（F：5′-AGAGTT-TGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）[4]，引物由上海生工生物工程有限公司合成。 　　1.1.3 仪器 TC-312 PCR仪（Techne公司，英国），EPS-100核酸电泳仪（圣科仪器设备有限公司，上海），Gel Logic 100凝胶电泳成像仪（柯达公司，美国）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 基因组DNA提取 参照文献[5]用Chelex-100法提取。 　　1.2.2 16 S rRNA基因扩增 16 S rRNA基因扩增反应体系由10×Ex Taq 缓冲液（Mg2+ Plus）5 μl、dNTP 混合物（各2.5 mmol/L）4 μl、引物F（10 μmol/L）及引物R（10 μmol/L）各2 μl、Ex Taq聚合酶 （5 U/μl） 0.25 μl、基因组DNA 4 μl组成，最后用无菌去离子水补足至50 μl。PCR反应条件为95℃预变性5 min，然后95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环后72℃延伸5 min。 　　1.2.3 扩增结果检测 取5 μl PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色后通过凝胶电泳成像仪照相观察，确认目标基因扩增成功后，PCR产物送北京天一辉远生物科技公司测序。 　　1.2.4 同源性鉴定 将测得的16 S rRNA基因序列用Vector NTI Advance（v.11.5.1）序列分析软件包进行人工校读，去除两端测序图谱不清容易引起混淆的序列，并对2个引物的双向测序结果进行拼接[6]。登陆GenBank（http：///genbank）和核糖体工程数据库（http：///index.jsp），将测得的各菌株的16 S rRNA基因序列与基因库中已注册的核酸序列进行同源性比对。 　　2 结果 　　2.1 16 S rRNA基因扩增结果 　　所有菌株的16 S rRNA基因均扩增成功，反应产物经电泳检测在约1500 bp处有一清晰条带，与预期目的片段长度相符（表1）。 　　3 讨论 　　传统的细菌鉴定以分离培养为前提，然后依据其形态学、生理生化特征进行鉴定，从标本采集到得出明确的鉴定结果往往需要3～4 d甚至更长时间，且准确性不十分理想，给临床及时指导诊治带来一定的困难。微生物自动鉴定系统的推广应用使这一现象有所改观，但这种完全基于表型特征的鉴定技术仍然具有内在的缺陷。PCR扩增技术及D