体外缺血后处理对缺血再灌注损伤大鼠肾小管上皮细胞间质转变的影响.docVIP

体外缺血后处理对缺血再灌注损伤大鼠肾小管上皮细胞间质转变的影响 　　[摘要] 目的 探讨缺血后处理对肾小管上皮间质转变的影响。 方法 应用NRK-52E建立有效的体外模型，实验分为对照组（COS）：应用对照缓冲液培养，3 h后换完全培养基培养；缺血再灌注损伤组（IRI）：应用缺血缓冲液，3 h后同样更换完全培养基培养；缺血后处理组（IPO）：应用缺血缓冲液培养3 h，立即行体外缺血后处理，然后更换完全培养基。以上各组于处理3、6、12、24 h后收集细胞，Hoechst用于检测细胞凋亡，蛋白印迹法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）的蛋白表达水平。 结果 在经历缺血3 h后再灌注24 h，IRI组和IPO组有明显细胞凋亡，但IPO组凋亡明显较IRI组减轻（P 0.05）。IRI组α-SMA随时间延长表达逐渐增强，在24 h时表达最强（P 0.05）；而IPO组随时间延长表达逐渐减弱，在24 h时达到最低值（P 0.05）。IRI组TGF-β1在缺血再灌注3、6 h时表达较强，之后减弱；且IPO组表达与IRI组相似，但3、6 h时表达水平明显受到抑制。IRI组CTGF在缺血再灌注3、6 h时表达较强，之后减弱；而IPO组表达各时间点较COS组没有明显变化。 结论 体外缺血再灌注损伤可以诱导肾小管上皮细胞α-SMA的表达，诱导上皮细胞间质转化；而原因可能与激活TGF-β1，进而也抑制基质蛋白的降解，促进基质蛋白CTGF的表达等有关；同时IPO能有效抑制α-SMA、TGF-β1、CTGF的表达，说明其能抑制间质转化的发生。 　　[关键词] 缺血后处理；上皮细胞间质转变；肾纤维化 　　[中图分类号] R692.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（b）-0009-04 　　肾缺血再灌注损伤不仅可以在短期内引起肾功能不全、衰竭，而且还可以导致慢性肾小管间质纤维化。肾小管间质纤维化是各种病因的肾脏疾病进展到终末期肾病的必要环节，而肾小管上皮细胞间质转变（EMT）在肾纤维化过程中扮演重要角色。因此，本研究利用笔者已经建立的成熟的体外模型，研究体外缺血后处理是否对缺血再灌注损伤导致肾小管EMT产生影响，现报道如下： 　　1 材料与方法 　　1.1 实验细胞 　　肾小管上皮细胞系NRK-52E购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心，培养于培养皿中，95%空气/5% CO2、pH 7.4、37°C条件下，每2天更换培养液。所有细胞均在实验前用无血清的培养基培养24 h。 　　1.2 主要药物、试剂 　　DMEM培养基，胎牛血清（美国，Hyclone）；Annexin V-FICT/PI双染试剂盒（美国，Bender，B MS1031） ；三气细胞培养箱（美国，REVCO公司）；α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体，转化生长因子-β1（TGF-β1）单克隆抗体，结缔组织生长因子（CTGF）单克隆抗体（cell signaling），β-actin单克隆抗体（Santa cruz） 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 细胞模型的建立 　　1.3.1.1 对照（COS）组 同步化24 h后，用对照缓冲液1 mL，培养3 h，然后更换DMEM 培养基2 mL，在正常条件下（5%CO2+95%空气、37℃）培养至指定的时间点。 　　1.3.1.2 缺血再灌注损伤（IRI）组 同步化24 h后，用pH 7.4的无血清DMEM培养液1 mL冲洗已汇合成片的大鼠肾小管上皮细胞，接着用pH 7.4的无糖DMEM培养液1 mL冲洗细胞，再用无血清、无糖的缺血培养液1 mL在缺氧条件下（0.5%O2+5%CO2+94.5%N2、37℃）培养3 h，再灌注时换用完全DMEM培养基2 mL，在正常条件下（5%CO2+95%空气、37℃）培养至指定的时间点。 　　1.3.1.3 缺血后处理（IPO）组 同步化24 h后，更换缺血缓冲液1 mL，并在缺氧条件下（0.5%O2、5%CO2、饱和湿度）条件下培养3 h，然后添加0.5 mL新鲜的完全培养基，在正常条件下（空气氧浓度、5%CO2、饱和湿度、37℃）培养10 min，模拟再灌注环境，再在缺血条件下（0.5%O2、5%CO2、饱和湿度）培养10 min，模拟缺氧环境，此20 min为1个循环，共计3个循环。最后添加完全培养基2 mL在正常条件下（空气氧浓度、5%CO2、饱和湿度、37℃）培养至指定的时间点。 　　1.3.2 观察指标与测定方法 　　肾小管上皮细胞NRK-52E在缺血再灌注损伤和缺血后处理后3、6、12、24 h各时间点，收集细胞提取总蛋白，行Weste