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甘草酸提取及抑菌活性研究 　　摘要：以新疆乌拉尔甘草饮片为原料，研究了在超声波条件下影响甘草酸提取率的几个因素，结果表明：以浓度为60%的乙醇为提取剂，料液比1：15，超声作用时间40min，浸泡4h为最佳。此外，分别以甘草酸对真菌（包括棉花枯萎病菌、小麦纹枯病菌、辣椒根腐病菌、辣椒疫病病菌）进行抑菌活性研究，结果表明浓度为1000mg/L的甘草酸对小麦纹枯病菌抑制率为68.15%，抑菌作用明显，对棉花枯萎病菌、辣椒根腐病菌、辣椒疫病病菌抑制作用相对较弱。 　　关键词：甘草；甘草酸；提取工艺；抑菌研究 　　中图分类号：TB文献标识码：A文章编号：1672-3198（2013）08-0187-02 　　甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）是豆科（legumrrihiza）甘草属（glycyrrhiza）植物的根或根茎中提取的一种天然甜味剂。研究表明甘草酸具有广阔的应用领域，且应用价值极高，但提取效率、成本、纯度又是影响效能的关键问题之一。超声辅助提取在天然植物有效成分的提取中取得良好的效果，且在甘草酸类或同类物质的提取中收效明显，表现出省时、选择性好、收率高、操作方便等一系列满足技术和市场方面的优点。为此，我们提出利用超声波的各种优良特性，在不影响甘草酸的物化、生物活性的基础上，不同条件下促进甘草酸的提取率。 　　从保护生态环境的角度来看，甘草酸对人体无害而有益，本研究以甘草酸乙醇提取液对真菌进行抑菌活性研究，以甘草酸做为新型杀菌剂防除农田有害病源微生物，将可能成为绿色农药发展的一个新方向。 　　1材料与方法 　　1.1材料及设备 　　材料：甘草饮片购于益和大药房；试剂：glycyrrhizicacid（SIGMA），其他试剂均为分析纯；供试菌种为吉林农业大学实验室提供。 　　主要设备：KQ5200E超声波清洗器昆山超声仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；UV-2000紫外-可见分光光度计尤尼柯有限公司；DHP-9162电热温恒培养箱上海齐欣科学仪器有限公司。 　　1.2方法 　　1.2.1提取工艺设计 　　准确称取甘草粉末5g，加入10mL 70%的乙醇溶液，浸泡后超声波辅助提取2次，抽滤，合并滤液。吸取0.2mL提取液用70%的乙醇定容至25mL，取定容后溶液4mL二次定容至25mL，测定溶液吸光度。采用反复结晶法，将甘草酸超声波粗提液加酸沉淀，再经乙醇溶提，氨化成盐析出，反复结晶得到甘草酸纯品。 　　1.2.2标准曲线的制备 　　取甘草酸纯品0.25g，溶于50 mL 70%乙醇溶液中，分别吸取上述甘草酸溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，用70%乙醇稀释至250 mL，零号管作参比，254nm处测其吸光度A，按标准曲线法计算其含量。 　　甘草酸含量=（C×250×50×10-6）÷（W×4×100%） 　　式中：C为查标准曲线所得浓度值（μg/mL），W为样品重（g）。 　　1.2.3抑菌试验 　　（1）清水洋菜培养基：琼脂15g，水1000mL。 　　（2）PDA培养基：马铃薯270g切片，水煮到有香味，过滤出切片，滤液再次煎煮同时放入15g琼脂，18g葡萄糖，熬匀后定容到1000mL。 　　首先取清水洋菜培养基约15mL，铺于培养皿底部，作为底层培养基。分别移取辣椒疫病病菌（Phytophthora capsici），棉花枯萎病菌（Fusariumoxysporum f.sp.vasinfectum），小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis），辣椒根腐病菌（F.solana）稀释液约2mL倒入150mLPDA培养基中，待清水洋菜培养基冷凝后向其中倒入已加入各种菌的PDA培养基10mL，冷凝后利用牛津杯用药，将甘草酸配制成50mg/L、1000mg/L的溶液，两种浓度的甘草酸各取3个培养皿培养，以不加甘草酸的培养基为对照，冷凝后利用抑菌圈法进行试验，72h后观察结果。根据菌落生长情况，在对照菌落即将长满培养皿时测量菌落生长直径，抑菌率按照下列公式计算： 　　病菌相对抑制率= 　　（对照菌扩展直径-0.6cm）-（菌种扩展直径-0.6cm）对照菌扩展直径-0.6cm×100% 　　（牛津杯直径为0.6cm） 　　2结果与分析 　　2.1甘草酸提取工艺的优化 　　通过对浸泡时间、乙醇浓度、料液比、提取时间等影响提取效果因素的单因素实验，各单因素初始固定条件是：浸泡时间为2 h、乙醇浓度为50%、料液比为1∶5、提取时间为20 min，以甘草酸提取率为考察指标，据单因素试验结果，运用L9（34）进行正交实验，以确定最佳提取工艺路线，见表1、表2。 　　表1L9（34）试验因素水平 　　因素水平