生姜蛋白酶的提取纯化工艺研究..docx

生姜蛋白酶的提取纯化工艺研究学生姓名： 指导教师： 摘要：生姜蛋白酶是一种有待开发利用的新的植物蛋白酶。本实验对生姜蛋白酶的提取方法和纯化工艺进行了研究。实验中使用以乙醇或丙酮为溶剂的有机溶剂沉淀法和硫酸铵盐析法提取生姜蛋白酶，测定各方法提取物的蛋白含量和酶活性，确定最佳的提取方法。再通过双水相萃取和反胶束萃取两种方法纯化粗酶。双水相萃取是用PEG4000/硫酸铵、PEG4000/NaH2PO4-Na2HPO4两种双水相体系，反胶束萃取是用AOT/异辛烷、CTAB/正辛醇两种反胶束体系。关键词：生姜蛋白酶；有机溶剂沉淀法；硫酸铵盐析法；双水相萃取；反胶束萃取Research on extraction and purification of Ginger proteaseStudent: GUO Bo-hua Teacher: LI Hai-yun, LI Zi-yuan, LIU Hong-yanAbstract: Ginger protease is a pending development and utilization of new plant protease. The experiments on Extraction of ginger protease and purification process were investigated. With ethanol or acetone as extraction of ginger protease organic solvent precipitation and ammonium sulfate salting out method used in the experiment, protein and enzyme activity of the extracts, the optimum extraction method. The purification of crude enzyme of aqueous two-phase extraction and reverse micelles extraction two methods. Aqueous two-phase extraction with PEG4000/ ammonium sulfate, PEG4000/NaH2PO4-Na2HPO4 two aqueous two-phase system, reversed micellar extraction is used AOT/ isooctane, CTAB/ octanol two reverse micellar system.Key words: Ginger protease; organic solvent extraction; ammonium sulfate salting-out; aqueous two-phase extraction; anti-micelle extraction前 言生姜蛋白酶是在继木瓜蛋白酶等以后发现的一种新的植物蛋白酶，它在结构与性质上与木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及无花果蛋白酶等具有很多的相似性，被认为是木瓜蛋白酶家族的又一新成员。生姜蛋白酶在肉类嫩化、酒类澄清以及凝乳中均具有广泛的应用前景，开发潜力较大。生姜蛋白酶用于肉类嫩化，不仅可以显著提高肉的嫩度，而且可以使其具有良好的风味。生姜蛋白酶用于酒类澄清，可显著提高啤酒和葡萄酒的澄清度[1]。1968 年，MiChi 等人首先报道了生姜蛋白酶。1973 年，Thompson等人从生姜根茎中提取了生姜蛋白酶，并命名为 Zingibain，并指出它具有较高的最适温度(60 ℃ )等特性，因此有较好的应用前景。同年，Ickikawa 和 Roshie 等人用 DEAE—纤维素柱层析对该酶进行了纯化，证明该酶是由两个组分(GP—1、GP—2)构成的，除电泳迁移率外，两个组分在其他方面基本相同；用 Sephadex G—100 测得两个组分的分子量均为 22500，该酶结晶为六面体。1978 年，Ohtsuki、kozo 等人用 P—100 生物胶过滤对该酶进行纯化，得出该酶分子量为 29000。1995年，Ohtsuki发表论文，报道了用 DEAE—Sepharose和 Sephadex G—75 纯化生姜蛋白酶之后，用等电聚焦电泳可将该酶分为三个组分，并用 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳和 TSKG2000SW 凝胶过滤再次证明该酶分子量为 29000。同年，赵帜平等以安徽舒城的生姜为原料，采用 DEAE—纤维素 DE—52 和 SephadexG—75 纯化得两个组分，用苯酚—硫酸法鉴定均为糖蛋白，并证明糖肽键型均为非 O 型。1999 年