环境微生物学第1章 病毒01--精.ppt

? 溶原性噬菌体的命名 在敏感菌株的名称后面加一个括号，在括号内写上溶原性噬菌体λ。 大肠杆菌溶原性噬菌体的全称为 Escherichia coli K１２(λ) Escherichia 是大肠杆菌的属名，coli 是大肠杆菌的种名，K１２是大肠杆菌的株名，括号内的λ代表溶原性噬菌体。 四、 病毒的测定与培养（自学） 病毒的测定 病毒颗粒计数法 间接计数法 病毒感染效价测定法 （一）病毒的测定 1、病毒颗粒计数法 用电子显微镜直接计数。用于已知形态病毒的浓缩样品的计数。 测定方法：将病毒样品与已知浓度的乳胶小颗粒均匀混合，然后将混合液均匀喷洒在已包被的样品方格网上，分别计乳胶颗粒和病毒颗粒数目。病毒的浓度可由样品中两种颗粒的比例和乳胶颗粒浓度计算得出。 2、间接计数法 血细胞凝集试验（hemagglutination assay）计数 测定方法：分别将红细胞与一系列10倍稀释的病毒样品混合，再观察结果。以能引起血细胞凝集的最高稀释倍数（或稀释倍数的倒数）为病毒的效价。 3、病毒感染效价测定法 病毒感染效价测定法与病毒培养方法基本相同。 （二）病毒的培养特征1、病毒在液体培养基中的培养特征 将噬菌体的敏感细菌接种在液体培养基中，经培养后敏感细菌均匀分布在培养基中而使培养基浑浊。然后接种噬菌体，敏感细菌被噬菌体感染后发生菌体裂解，原来浑浊的细菌悬液变成透明的裂解溶液。 噬菌体在液体培养基中的培养特征 A.被噬菌体感染之前培养液浑浊 B.被噬菌体感染之后培养液变清 2、病毒在固体培养基上的培养特征 将噬菌体的敏感细菌接种在琼脂固体培养基上生长，形成许多个菌落，当接种稀释适度的噬菌体悬液后引起点性感染，在感染点上进行反复的感染过程，宿主细菌菌落就一个个地被裂解成一个个空斑，这些空斑就叫噬菌斑。 噬菌体在固体培养基中的培养特征 C.细菌菌落， D.四个菌落被噬菌体感染成噬菌空斑 噬菌斑 （三）病毒的培养基 病毒的培养基应具备的条件： ① 必须是活的敏感动物或是活的敏感动物组织细胞； ② 能提供病毒附着的受体； ③ 敏感细胞内没有破坏特异性病毒的限制性核酸内切酶，病毒进入细胞就可增殖。 1.脊椎动物病毒培养基 ① 人胚组织细胞 ② 人组织细胞 ③ 人肿瘤细胞 ④ 动物组织细胞 ⑤ 鸡、鸭胚细胞 ⑥ 敏感动物 2.植物病毒的培养基 与相应的敏感植株和敏感的植物组织。 3.噬菌体的培养基 与噬菌体相应的敏感细菌，如大肠杆菌噬菌体用大肠杆菌培养。 （四）病毒的培养 1、 病毒样品的采集与制备 病毒存在于动、植物病灶组织、体液、分泌物、粪便、下水污泥、活性污泥、污水、河水、湖水、海水等处。 固体病毒样品采得后，加液体培养基制成悬液，以10000 r/min 离心10 min，去除杂质，取其上清液备用。 液体病毒样品直接以10000 r/min离心10 min，去杂质，取其上清液备用。 空气病毒样品采用真空泵抽取至长有宿主菌的平板上，或是将长有宿主菌的平板打开盖，在空气中暴露 30～60 min以收集。 若样品中病毒浓度大则要适当稀释，若样品中的病毒浓度小则要浓缩。 2、动物病毒的培养：动物病毒的空斑试验 (1)单层细胞的制备和培养：用无菌小刀将动物组织切成0.5～1mm3的小块，用平衡盐溶液(Hanks或 Earles)洗涤数次，加体积分数5％胰酶消化10～15min(有的消化时间长至30min，甚至十几小时)，将细胞间的“间质蛋白”水解，使细胞分散，将胰酶冲洗掉，吹散细胞并计数。加入含牛血清的生长液，分装，保持37℃温度，培养2～3d即长成单层细胞，以备培养病毒用。还可经传代后再培养病毒。 (2) 动物病毒的接种与观察 ① 将病毒悬液置于单层细胞的表面，经适当时间孵育，使病毒最大限度地吸附在宿主细胞上。 ② 将软琼脂或羧甲基纤维素注入铺在单层细胞表面，经过一定时间培养，结果在单层细胞上呈现出空斑。 ③ 以出现的空斑数判断病毒数ηPFU（病毒空斑单位）。 3、噬菌体的培养和测定 噬菌体的效价即1mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼脂平板法。 双层琼脂平板法 倒下层琼脂 ： 融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。 倒上层琼脂 ： 融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入敏感指示菌 (大肠杆菌) 菌液0.2mL，待检样品液或上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒