04 核酸化学课件.pptVIP

赵丹丹 第4章 核酸化学 * 增色效应（hyperchromic effect） DNA变性时其溶液A260增高的现象 赵丹丹 第4章 核酸化学 * 4、DNA的热变性 熔点或熔解温度（melting temperature ，Tm ）：通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度。 DNA熔解曲线：在DNA连续加热变性过程中，以A260对温度作图，可得到一条S形熔解曲线。 DNA变性的特点：爆发式，变性作用发生在一个很窄的温度范围内，有一个相变的过程。 赵丹丹 第4章 核酸化学 * Tm值一般在82℃ ～95℃之间，大小与G+C含量成正比。 DNA中GC含量与Tm值的关系可用经验公式进行计算： （G+C）%=（Tm – 69.3）×2.44 影响Tm的因素 DNA的均一性 GC含量：公式 介质中的离子强度： 在高环境下Tm值较高，且溶解温度范围狭窄。所以DNA在含盐缓冲液中保存较稳定。 赵丹丹 第4章 核酸化学 * 5、 RNA的变性 RNA分子中有局部双螺旋区，所以也可以发生变性。 特点：只是Tm值较低，且范围较宽。 赵丹丹 第4章 核酸化学 * 6、DNA的复性（renaturation） DNA变性是可逆的，解除变性条件并满足一定条件后，解开的两条DNA互补单链可重新恢复形成双螺旋结构，并恢复有关的性质和生物功能，这个过程称为DNA复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。 减色效应(hypochromic effect)DNA复性时溶液A260降低。 复性过程可在溶液里，也可在固相支持物表面进行。 赵丹丹 第4章 核酸化学 * 聚合酶链反应(PCR) 变性 denaturation 95?C 延伸 prolongation 72?C 退火 annealing Tm-5?C 赵丹丹 第4章 核酸化学 * 引物 延伸 延伸 5’ 5’ 3’ 3’ 变性、退火 变性、退火 赵丹丹 第4章 核酸化学 * 六、核酸的分子杂交技术 赵丹丹 第4章 核酸化学 * 1、核酸分子杂交的定义 在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交（nucleic acid hybridization ) 。 变性 复性 赵丹丹 第4章 核酸化学 * 2、分子杂交 Southern blotting （DNA-DNA） Northern blotting （ DNA-RNA ） Western blotting （Protein-Protein） 赵丹丹 第4章 核酸化学 * 3、核酸分子杂交的应用 研究DNA分子中某一种基因的位置 定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 基因芯片技术的基础 4.6 核酸的分离、纯化和鉴定 赵丹丹 第4章 核酸化学 * 一、DNA的分离 真核生物中的DNA与 组蛋白结合成核蛋白(DNP)形式存在于核内 DNP溶于水和浓盐溶液，但不溶于生理盐溶液 苯酚或氯仿-异戊醇混合液可使蛋白质变性而除去蛋白质 DNA中的少量RNA可用RNase除去 氯化铯密度梯度离心 赵丹丹 第4章 核酸化学 * 二、RNA的分离 制备RNA的方法： 用酸性盐-苯酚-氯仿抽提：小量制备RNA 用盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心：大量高纯度的RNA 异硫氰酸胍：极强烈的蛋白质变性剂 Trizol Reagent（ Invitrogen，15596-026） 赵丹丹 第4章 核酸化学 * 三、核酸含量测定法 紫外分光光度法 定磷法：钼蓝法 定糖法：比色法 凝胶电泳法 赵丹丹 第4章 核酸化学 * 1、定磷法：钼蓝法 DNA,RNA中磷含量恒定(9.5%)，测定样品中的磷可以推测核酸含量。 原理：先将核酸样品用强酸（浓硫酸、过氯酸）消化成无机磷酸；然后，磷酸与定磷试剂中的钼酸反应生成磷钼酸，它在还原剂Vc作用下还原成蓝色的钼蓝复合物；最后在650～660nm下比色测定，得出总含磷量(核酸磷+无机磷),再减去无机磷（即不经消化直接测定)的量即为核酸磷的真实含量，此值乘以系数10.5(100/9.5)即为核酸含量。 赵丹丹 第4章 核酸化学 * 2、定糖法：比色法 （1）苔黑酚又称地衣酚法—测定RNA 方法：RNA在浓盐酸或浓硫酸作用下，受热发生降解，生成的核糖进而