核酸分离纯化-经典版案例.ppt

荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV 激发下发出红色荧光。荧光强度的强度与溶液中核酸的含量呈正比。 使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。 （五）核酸的鉴定与保存 EB与DNA的结合 浓度鉴定 紫外分光光度法： 主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。 纯度鉴定 （五）核酸的鉴定与保存 核酸的分离纯化技术 核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。 概 述 一、核酸分离、纯化原则 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 1.意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。 2. 实验过程中，应注意以下条件及要求： 1）减少化学因素对核酸的降解:pH4-10 2）减少物理因素对核酸的机械剪切力：0-4?C 强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中，细胞裂解，反复冻贮等造成的机械剪切力等条件都能明显破坏大分子量的线性DNA分子，对于分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，威胁相对小一些；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的条件下进行。 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 3）抑制DNase或RNase的活性： 所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。 4）简化步骤，缩短时间，减少破坏。 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 3.DNA酶抑制剂 (1）金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA、柠檬酸盐络合Mg2+、Ca2+等离子。 (2）阴离于型表面活性剂： 如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 4.RNA酶（RNAase)抑制剂 RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。 (1) 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 (2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意： DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。 容易降解，保存在4℃或液氮中； 提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。 剧毒。 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 4.RNA酶（RNAase)抑制剂 （3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC) 4.RNA酶（RNAase)抑制剂 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 一、核酸分离、纯化原则 (二)尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度 纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度；无其它核酸分子的污染，如提DNA分子时，应去除RNA分子。 破碎组织细胞 提取 纯化 I.材料与方法的选择 II.破碎细胞或包膜－核酸的释放 III.核酸分离、纯化 IV.核酸的浓缩、沉淀、洗涤,并去除杂质 ? V.核酸的鉴定与保存 二、分离提取核酸的主要步骤 临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及体外培养的细胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据实验的目的来确定。 不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。 需考虑制备核酸所需的时间与成本：简便快速、安全、经济； 应选择安全的试剂与制备方案：完整性、产量、纯度和浓度符合实验要求。 （一）材料与方法的选择 临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及体外培养的细胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材料的选择应根据实验的目的来确定。 不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。 需考虑制备核酸所需的时间与成本：简便快速、安全、经济； 应选择安全的试剂与