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在合适的时间点检测凋亡 作者：TERRI SUNDQUIST, M.S., RICH MORAVEC, B.S., ANDREW NILES, M.S., MARTHA O’BRIEN, PH.D., AND TERRY RISS, PH.D., PROMEGA CORPORATION凋亡是指与细胞死亡相关的一系列的特定的细胞形态学变化。我们列出了一些影响因素，这些因素可能会对凋亡相关的生物化学事件产生的时间产生影响，并着重阐述在某适合的时间区段内监测这些生化事件的重要性。 引言细胞死亡会发生一系列的作用通路不同的细胞形态学和生物化学变化，包括凋亡、坏死和自我吞噬(1)。“凋亡”这一名词最先由Kerr等人（2）创建，用来描述具有确定的形态学变化的细胞死亡，包括细胞皱缩、染色质浓集、核膜的完整性消失、胞膜空泡化（plasma membrane blebbing）、最后形成凋亡小体。虽然凋亡指的是纯粹的形态学变化，但是在这些形态学变化中常伴随着生物化学反应的发生。这些生化反应包括启始Caspase酶和效应Caspase酶的激活、线粒体细胞色素C的释放、质膜磷脂酰丝氨酸的外化，多聚[ADP-核糖]聚合酶（PARP）的降解和核DNA的断裂。 这些生物化学事件并不都是凋亡所特有的，不会在所有的凋亡细胞或凋亡的所有阶段都发生，也不会在所有凋亡诱导剂刺激时都发生。这些生化事件发生的时程也有很大差别，并受许多因素的影响，包括细胞系或组织、凋亡诱导剂、药物浓度或刺激强度和暴露时间。因此，有策略地选择检测哪些生化事件就变得十分关键，通过检测这些生化事件可以证实细胞的死亡是由于凋亡引起的，同时，还可以了解细胞死亡的动态过程。本文中我们主要讨论了在适宜的时间段内检测这些生化事件的重要性，确保这些变化被捕捉到，而不致错过。我们也列出了一些可能会影响相关生化事件的检测时限的因素。 细胞凋亡过程中的生化事件的时限通常，细胞凋亡是通过外部的或内部固有的途径而进行的。外部（受体介导的）途径涉及受体结合、激活起始caspase酶 （ caspase-8）、caspase-8继而激活caspase-3或者切割Bcl-2家族成员Bid，从而放大caspase-3的激活效应；Bid的切割导致细胞色素C漏出、蛋白复合体（也称作凋亡复合体）的形成，以及caspase-9的激活（3）。内部固有（线粒体介导的）途径涉及某些Bcl-2家族成员，这些成员可以调节细胞色素C从线粒体中的释放。细胞色素C一旦从线粒体中释放出来，就会与Apaf-1、dATP和caspase-9前体形成凋亡复合体。作为凋亡复合体的一部分，caspase-9经过某种处理而被激活，激活的caspase-9继而激活caspase-3。在这两种途径中，晚期凋亡事件在效应caspase酶被激活后发生，包括质膜外表面磷脂酰丝氨酸的暴露（可通过锚定蛋白V的结合而被检测到）、多聚[ADP-核糖]聚合酶（PARP）的降解和核DNA断裂。 生物化学事件发生的精确时间取决于凋亡途径。另外，凋亡被诱导后，检测不同的生化事件或活性的时间点往往也是不同的。例如，使用抗Fas单克隆抗体（mAb）处理Jurkat细胞，凋亡的外部通路即被激活，Fas受体形成三聚体，引发构象变化，促使死亡诱导信号复合体（DISC）形成。使用抗Fas单克隆抗体处理Jurkat细胞后，caspase-8活性在处理后3小时就达到峰值，而caspase-3/7活性在测量的7小时内逐渐增加（图1）。PARP在处理后6小时达到降解高峰，而晚期事件-DNA断裂，直到处理后9小时仍没有达到峰值（图2）。在最佳测量时间段之前或之后对这些事件进行检测，都可能导致测量的信号与背景（比较1小时和7小时时溶剂对照组和抗Fas单克隆抗体处理组的caspase-8活性，图1）相比太弱或没有，从而导致结论错误，认为该处理方式不会诱导细胞凋亡。因此，根据经验确定在什么时候目标活性出现峰值是非常关键的。所以，研究者应进行预实验来确定某一检测的最佳时间，或实验时，确保在足够长的一段时间内进行检测，并设立多个间隔适当的检测时间点，以捕捉到活性峰值。 图1. caspase-8和caspase-3/7活性的时间依赖性。按25000个细胞/孔的密度接种Jurkat细胞，每小时加入抗Fas单克隆抗体或溶剂，共7小时。使用 Caspase-Glo? 8发光试剂盒检测caspase-8活性，底物为Z-LETD 氨基萤光素。使用改进的荧光Apo-ONE? Homogeneous Caspase-3/7试剂盒检测caspase-3/7的活性，底物为 (Z-DEVD)2-R110。室温孵育1小时后，记录同一孔的发光值和荧光值(4)。 图2. TUNEL和PARP降解的时间过程。按照图示的时间用抗-Fas单