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肝脏巨噬细胞(KCs)的分离与培养 研究生：魏思东 戴卓娅导师： 龚建平 2010-05-04 肝脏细胞悬液制备 门静脉穿刺，以10ml／min流量经门静脉灌注PBS ，直至肝脏呈黄白色，总量约20ml。再用20ml 0.05％的Ⅳ型胶原酶溶液(sigma ，PBS液稀释)门静脉灌注(小鼠不用此步骤）。 取下肝脏加入20ml 0.05％胶原酶，37 oC孵育40 min，经200目细胞筛过滤。 PBS稀释至50ml, 300×g 5 min，4oC，离心洗涤2次，取沉淀PBS稀释至50ml，用50g×g 3min, 4oC离心，弃沉淀，将上清液以300×g，5min, 4oC离心，取沉淀。 用镊子划碎肝组织 装入试管消化 肝脏消化吹打后细胞悬液 细胞悬液过滤 洗涤与肝细胞沉淀 梯度离心 Percoll原液9份加入1份PBS（10倍浓度）配成100%的SIP。 取4支无菌离心管，沿着管壁加入2 mL 50％的SIP，然后倾斜（60o）试管，轻轻的沿着管加2mL25％的SIP细胞悬液（小鼠2管，大鼠4管）。 500×g，离心15 min，4oC， 50％的SIP和25％的SIP层面之间有一层白色物，吸管轻轻的吸取之，置离心管中，用PBS离心清洗2遍，弃上清(300×g，5min)。 非肝细胞SIP离心准备 SIP离心后细胞层与洗涤 细胞贴壁 把细胞按5x105/ml浓度种植于培养板中，培养2h。取出培养板，用37℃的PBS液轻轻冲洗3次，去除未贴壁细胞，贴壁细胞即为实验所用的KCs。 刚分离出的细胞 KCs的培养方法培养 5％CO2、37℃、95％湿度。换液间隔时间为2d。培养基配方为DMEM（H）+双抗+10%胎牛血清（HyClone）。 2天及3天KCs 2周及3周KCs KCs的鉴定活力判定 通过形态学观察及吞噬功能鉴定活力：在体外培养的24孔板细胞换液时，加入已消毒碳素墨水的培养基(1/250)，2 h后倒置显微镜观察，记数200个细胞，观察具有吞噬功能的细胞数量。0.2%台盼蓝拒染色判断细胞活力。 F4/80免疫荧光鉴定KCs（小鼠）， CD163免疫组化鉴定KCs（大鼠）,阳性为KCs。 KCs 吞墨图像与台盼蓝拒然图片 F4/80的免疫荧光和CD163 免疫细胞化学(x400) 致谢 感谢连峥嵘，徐宇飞，柴跃龙，宗开灿，廖汪洋，陈琦，等同学。 感谢其它关心和帮助我们的老师和同学。 求职应注意的礼仪 求职时最礼貌的修饰是淡妆 面试时最关键的神情是郑重 无论站还是坐，不能摇动和抖动 对话时目光不能游弋不定 要控制小动作 不要为掩饰紧张情绪而散淡 最优雅的礼仪修养是体现自然 以一种修养面对两种结果 必须首先学会面对的一种结果----被拒绝 仍然感谢这次机会，因为被拒绝是面试后的两种结果之一。 被拒绝是招聘单位对我们综合考虑的结果，因为我们最关心的是自己什么地方与用人要求不一致，而不仅仅是面试中的表现。 不要欺骗自己，说“我本来就不想去”等等。 认真考虑是否有必要再做努力。 必须学会欣然面对的一种结果----被接纳 以具体的形式感谢招聘单位的接纳，如邮件、短信 考虑怎样使自己的知识能力更适应工作需要 把走进工作岗位当作职业生涯的重要的第一步，认真思考如何为以后的发展开好头。 Thank you