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研究抑郁症大鼠模型前额叶组织BDNF因子的实验 　　抑郁症是目前世界上危害人类精神健康的一类由多种因素引起的情感障碍类疾病。患病个体具有高复发、高自杀率、高致残率及社会负担重等特点。甚至有学者预测至2020年该病的将上升为继冠心病后全球第二大负担沉重疾病。近年来多项研究结果表明，脑内神经营养因子-Bdnf因子的减少与抑郁症有着密切的关系。本实验即采用了慢性不可预知刺激同时结合独笼孤养的方法，研究了临床常用抗抑郁药物氟西汀对抑郁症模型大鼠脑内海马区、杏仁核及额叶BDNF因子的作用效果，深入探讨抗抑郁药物在抑郁治疗过程中的有关机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　(1)实验动物分组实验动物：选取30只成年SD大鼠(SPF级)，雌雄各15只，体重170～210mg，全部从实验动物研究中心提取。按随机法将其分为3组，每组10只。(2)药物 盐酸氟西汀分散片(礼来苏州制药有限公司，生产批号：2012010809)，20mg/片，用蒸馏水配制成。(3)试剂与仪器：荧光定量PCR仪。 　　1.2 方法 　　(1)造模方案：参考katz[3]等方法，正常对照组每笼5只，余每笼1只饲养，后者接受4周的慢性随机不可预知刺激：夹尾(每次2分钟)、足底电击(电流10mA，隔1min刺激一次，共15次)、禁食(24h)、禁水(24h)、冷水游泳(4℃，5min)、强迫游泳、摇晃、昼夜颠倒，每天安排一种刺激方式，共进行4周各种不同的刺激。(2)药物干预方案：正常对照组：正常条件饲养;模型组：正常饲养并造模;药物干预组：造模，氟西汀药液灌服，剂量相当于0.18mg/ml，每日1次，连续两周。 　　1.3 行为学评估方案 　　旷场实验：旷场箱由不透明材料制成，底面为8 0 c mtimes;8 0 c m并被分为6 4个等边方格，周围箱体侧壁高4 0 c m，安静观察，观察指标为大鼠在中央格停留时间及5分钟内穿越格数、后肢直立次数、修饰次数、粪便粒数;上述记录分别在实验开始当日及之后每周进行一次;糖水消耗实验：实验前，在安静的房间内，训练大鼠适应含糖饮水，前48小时分别给予两次含糖饮水，接下去23小时的禁食禁水后进行事先定量好的两瓶水，一瓶为1%的蔗糖水，一瓶为纯水。2小时后取走两瓶水称重。计算各只大鼠糖水、纯水及总液体消耗，并计算糖水偏爱。之后每周行一次液体消耗实验。食物消耗量及体重评估:大鼠自实验开始起每周称重一次，并在称重/前24小时喂食物50g，称重同时称食物余量，同时计算食物消耗量及24小时摄食量(消耗食物量/大鼠体重); 　　1.4 标本采集及基因扩增 　　(1)采集标本：大鼠深度麻醉后，断头取出脑组织，剥离海马组织，利用冻存管来处理上收集的述组织，该冻存管要求为一次性灭活R N A酶的，以液氮存放，随后用- 8 0度冰箱存放。(2)引物设计：本次设计是通过利用genebank(NCBI)查询获得大鼠BDNF及Trkb基因序列。TrkB：上游5 GCTTCTGGAGGGCTTCTCTT3下游： 5 T G T T C T C T G G G T C A A T G C T G 3 ; B D N F ：上游5 A G C C T C C T C T G C T C T T T C T G 3 下游： 5GCTGTGACCCACTCGCTAAT 3;(3)RNA提取：将大鼠海马组织标本在液氮中磨碎，每5 0～1 0 0 m g组织中加入1mlTRIzol试剂，匀浆处理后室温放置5分钟予离心，取上清加入氯仿震荡再次放置3分钟离心，转移水相层液体使用异丙醇沉淀并放置10分钟，再次离心后75%乙醇洗涤RNA沉淀，室温干燥后加入RNase的水，溶解并-70度贮存RNA待用;(4)逆转录试验：按cDNA反转录试剂盒说明进行操作;(5)荧光定量PCR：计算依据是标准曲线及荧光曲线CT值(定量数据均通过均值plusmn;标准差表达)。 　　1.5 统计学处理 　　应用SPSS统计软件，数据使用(xplusmn;s)表示，运用t检验完成各组均值间比较。 　　2 结果 　　造模前，各组大鼠体重及行为学比较差异均无统计学意义。造模第3周至第4周，模型组较对照组体重、水平及垂直运动得分、糖水消耗减少，差异具有统计学意义，故说明孤养合并慢性应激复制大鼠抑郁模型成功，药物干预第3周开始，药物干预组较模型组体重增大、水平、垂直运动得分、糖水消耗增加，差异具有显著性(分别见表1～3)。从分子生物角度发现，抗抑郁药物氟西汀干预两周后大鼠海马区BDNF及Trkb数目明显较模型组增加，说明该生物因子及受体数目的改变在抑郁症治疗中发生改变。 　　3