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细胞粘附肽RGD 的液相合成的探究 　　精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸( Arg-Gly-Asp，RGD) 三肽是细胞粘附蛋白的识别位点，含有RGD 序列的多肽许多都具有抗粘附性能，可抑制肿瘤细胞与内皮细胞和基底膜的粘附，加速肿瘤细胞脱附，阻止肿瘤细胞滞留，从而抑制肿瘤细胞的转移。1984 年，Pierschbacher 等首次确定了RGD 序列为人纤维连接蛋白与其受体的结合位点。1985 年，Hayman 等将含RGD 序列的4 个寡肽与无RGD 序列的5 个寡肽进行细胞粘附活性研究，发现含RGD 序列的肽有抑制正大鼠肾、变异的鼠肾、鼠BALB /C373、人骨肉瘤( MG63) 和人纤维素瘤( HT1080) 细胞的粘附作用，而无RGD 序列的5 个肽则没有抗粘附活性。1987 年，Hynes报道，细胞表面存在与细胞粘附有关的ECM 糖蛋白受体，并将它们命名为整合蛋白。整合蛋白介导着许多种类的细胞与细胞及细胞与底物之间的相互作用，参与许多生物学过程，例如，体内平衡调节、吞噬作用、细胞迁移、细胞信号传递、淋巴细胞的识别、血小板的聚集等。由于许多病理学过程与正常的细胞外基质( ECM) 作用相关，含RGD 多肽或化合物有望用于某些疾病的治疗。例如，将携带效应分子的RGD 肽与整合素alpha;vbeta;3特异性结合，可以提高治疗效应分子的靶向性。因此，该类肽的类似物成为药物设计的一个新的靶点。综上所述，研究RGD 序列肽的合成具有重要意义。 　　在本文中，首先，采用一种新颖的化学法( 氨解取代法) 合成了二肽Gly-Asp，再利用N-羧基内酸酐法合成了游离RGD 三肽，这种化学合成肽的方法与传统上的化学法合成肽相比，具有高收率、低成本、合成量大的特点。 　　1 实验部分 　　1. 1 主要仪器与试剂 　　RE52 旋转蒸发仪( 上海亚荣生仪器厂) ; DHG-9070A 电热真空干燥箱( 上海精宏实验设备有限公司) ; Nicolet370 红外光谱仪( 美国Thermo 公司) ;LCMS-2010EV 液相质谱联用仪( 日本岛津公司) 。L-天冬氨酸( L-Asp) 、甘氨酸( Gly) 、Z-精氨酸( Z-Arg) ，购自上海晶纯化学公司; 乙酸乙酯、氯乙酰氯、氢氧化钠、无水乙醇、无水硫酸钠、四氢呋喃、三溴化磷、硼酸、四硼酸钾、正辛醇、氢氧化钾等均为市售国产分析纯试剂。 　　1. 2 实验方法 　　首先，将氯乙酰氯和L-Asp 在弱碱性条件下反应，然后使用浓氨水取代氯，合成GD 二肽( Gly-Asp) ，再利用N-羧基内酸酐法合成游离RGD 三肽。 　　1. 2. 1 L-Asp 的氯乙酰化将4. 8g L-Asp 与8mL 质量分数为27%的氢氧化钠溶液混合，并调pH 在11 ～ 12 之间，再加入8mL 乙酸乙酯，于冰浴下搅拌。以相同的速度滴加5mL 氯乙酰氯和27%的NaOH 到上述溶液中，保持pH 在11 ～ 12之间。滴速不能太快，滴完后继续搅拌30min。结束反应后用浓盐酸调节pH = 1. 5，用乙酸乙酯萃取3 次，取上清液，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜。减压旋蒸除去乙酸乙酯，得到微黄色油状物，静置过夜。油状物变为白色粉末。 　　1. 2. 2 氯乙酰化的L-Asp 氨解称取所得的2. 0g 氯乙酰化L-Asp，加入12mL 浓氨水，冰浴下搅拌36h。减压旋蒸上述反应液，得到微黄色的油状物。加乙醇振荡，除去醇溶物，出现微黄色不溶物。加热旋蒸，得淡黄色粉末。记为GD 二肽 　　1. 2. 3 NCA-Arg 的制备将5mL 四氢呋喃与3g ZArg在室温下激烈搅拌至完全溶解，加入5mL 三溴化磷与20mL 四氢呋喃的混合溶液。室温搅拌3h后，反应液未分层，旋蒸除去溶剂后，得到黄色焦油状物，真空干燥过夜 　　1. 2. 4 N-羧基内酸酐法合成RGD 三肽取1. 9g GD 二肽溶于pH = 10 的50mL 硼酸四硼酸钾缓冲液体系( 0. 3g 硼酸+ 0. 1mol /L 50mL 四硼酸钾1. 53g) 中。用氢氧化钾调节pH 至10，加入1 滴辛醇，在激烈搅拌下一次加入一定量的NCAArg，并不断加入氢氧化钾保持pH = 10( 用pH 计监测) ，约5min，加入浓硫酸调pH 至5 终止反应。反应液旋蒸除去水后，冻干。用少量水溶解后用乙醇沉淀，得到白的粉末状固体。 　　1. 2. 5 产物的结构表征将待测样品溶于乙腈中，采用高效液相色谱仪进行检测，采用5mu;m 的150mm times; 4. 6mm 色谱柱，流动相为V乙腈∶ V水=80∶ 20，以1. 0mL /min 的流速等度洗脱，上样量20mu