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细说HEK293 细胞的传代、建库与高效表达的研究 　　HEK293 细胞是转染腺病毒EIA 基因的人肾上皮细胞系，由加拿大Graham 教授于1976 年用DNA 转染技术构建而成，用于特异性腺病毒和腺相关病毒的培养。HEK293 含有SV40 复制起始点与启动子区的质粒，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许腺病毒和其他血清型腺病毒在其上复制，目前常用于以腺病毒作为载体的相关生物药和疫苗的研究。腺病毒在生物医药和基因治疗中因其具有以下优点，被广泛用作于载体：外源基因容量大，最大承载可达37 kb;感染范围广，能将目的基因转移到分裂或静息的细胞中;安全性高，感染细胞时其DNA 不整合到宿主染色体中，潜在的致癌危险小;能同时表达多个基因，它是第1 个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。腺病毒粒子相对稳定，外源基因插入片段在病毒连续复制几个周期后仍保持不变;外源基因表达水平较高，病毒滴度高，易于制备和纯化。目前已经证实人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)与宫颈癌的发生有关，其中高危型HPV 病毒(HPV16 和HPV18)感染占宫颈癌病例的80%。对HPV 预防性的疫苗目前已经面世，HPV治疗性疫苗主要针对HPV16 和HPV18 的早期肿瘤抗原E6 和E7。笔者和合作单位联合研发的能高效表达HPV16-E6E7 融合蛋白的重组腺病毒，在HEK293 细胞上培养，以期获得能诱发强免疫应答的HPV16 型治疗性疫苗[6]。本研究按中国药典2010 版Ⅲ部对疫苗研发用细胞基质的要求，对HEK293 细胞进行主库和工作库的建立，并能高效表达重组的HPV16-E6E7腺病毒，达到疫苗下一步研发的要求。 　　1 材料 　　1.1 细胞 　　HEK293 细胞(35 代)，购自美国ATCC(编号：CRL-1573)。 　　1.2 重组 　　HPV16-E6E7 腺病毒根据技术合作协议由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所田厚文教授研究团队提供的重组腺病毒rAd5-HPV16SmE7E6 株(12 代)。 　　1.3 试剂和耗材 　　DMEM 培养基(Gibco 公司);胎牛血清(Sigma公司);8% NaHCO3、3%谷氨酰胺、1%胰蛋白酶由本研究室制备。CF10 细胞培养用细胞工厂(NUNC);细胞培养瓶(美国CORNING);离心管(美国BECKMAN)。酶切反应中所用的限制性内切酶(美国NEB 公司);病毒基因提取盒(北京康为世纪生物科技公司)。 　　2 方法 　　2.1 HEK293 细胞库的传代和建库 　　HEK293 细胞35 代1 支，将细胞放入40 ℃水浴中融化，待完全融化后，以无菌操作法将细胞液转移至15 mL 离心管中，加入生长液6 mL 吹打分散细胞，分装至25 cm2 小方瓶内，37 ℃+5% CO2培养。细胞培养2~3 d 长成单层后进行细胞传代，弃去细胞生长液，0.25%胰酶消化液37 ℃消化约1 min，细胞出现裂纹后弃去消化液，加入细胞生长液，按同样方法传3 个代次至38 代，建立细胞原始库;继续传2 代至40 代，建立细胞主库;主库细胞传3 代至43 代，建立细胞工作库。 　　2.2 细胞库的检验细胞库的检验 　　参照中国药典2010 版Ⅲ部附录Ⅻ A。其中无菌试验和支原体检测参照中国药典2010 版Ⅲ部附录Ⅻ B。 　　2.3 重组HPV16-E6E7 腺病毒滴度的测定 　　用组织培养半数感染量(TCID50)方法：细胞培养方法同上。将待测样品10 倍倍比稀释，选用10?4到10?11，8 个稀释度进行上样，每个稀释度10 个复孔，同时设2 个正常细胞对照孔。在37 ℃，5%CO2 条件下培养48 h，弃去细胞生长液固定细胞，加腺病毒Hexon 单抗，37 ℃水浴1 h，PBS 溶液洗3 遍;加酶标二抗，37 ℃水浴1 h，PBS 溶液洗3遍，DAB 显色，15 min 后在显微镜下观察细胞，计数出现褐色或黑色的细胞斑点数，计算TCID50结果。滴度T=101+d(s?0.5)，d= 稀释度10 log =1(对于10 倍的稀释度而言);s=阳性比率之和。 　　2.4 重组HPV16-E6E7 腺病毒插入目的基因和基因组酶切图谱鉴定 　　2.4.1 PCR 反应步骤 取0.01~1 mu;L 样品进行PCR 反应。样品包括阴性对照(不含重组基因的空腺病毒，Ad5 空)，阳性对照(rAd5HPV16SmE7E6)，2 个待测样品(主种子库MSB，工作种子库WSB)，空白对照(只有试剂不含任何样品)，共5 个样本。