细说多硫代二酮哌嗪类化合物对肿瘤细胞的抑制作用.docVIP

细说多硫代二酮哌嗪类化合物对肿瘤细胞的抑制作用 　　多硫代二酮哌嗪类化合物( epipolythiodioxopiperazines，ETP) 是由真菌产生的一类次级代谢产物，具有广泛的生物学活性，包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫抑制及抑制多种酶活性( 如拓扑异构酶、酪氨酸激酶、ATP 合酶) 等。ETP 类化合物以含有硫桥键的二酮哌嗪母核为结构特征，硫桥键是其生物活性的关键基团，去除或断裂硫桥通常会导致其生物活性丧失。因ETP 类化合物结构新颖，立体化学独特，骨架类型多样，所以其活性研究一直备受关注。近年来，本研究集体从真菌次级代谢产物中获得多个新的ETP 类化合物。前期体外细胞实验研究显示，多个化合物对多种肿瘤细胞生长具有明显的抑制活性，其中C87 对肿瘤细胞生长的抑制作用最为明显。因此，本研究在细胞水平评价ETP 类化合物C87 的抗肿瘤活性，并探讨其可能的作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 药品、细胞、试剂和仪器 　　C87 为从冬虫夏草定殖真菌黏帚霉素属( Gliocladium sp.) 的发酵产物中获得的ETP 类化合物，以高效液相色谱法测定其纯度为95%。人肺癌A549 细胞和人结肠癌HCT116 细胞分别由本研究所王玉霞研究员和关勇彪研究员馈赠; 人宫颈癌HeLa 细胞和人肝癌SMMC7721 细胞由本实验室保存。DMEM 高糖培养基和胎牛血清( fetal bovineserum，FBS) 购自美国Gibco 公司; 三氯乙酸( trichloroacetic acid， TCA ) 、磺酰罗丹明B( sulforhodamine B，SRB) 、二甲亚砜( dimethylsulfoxide，DMSO) 和N-乙酰半胱氨酸( N-acetylcysteine，NAC) 购自美国Sigma 公司; 活性氧( reactive oxygen species，ROS) 检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。CKX41 倒置显微镜和BX51 荧光显微镜，日本Olympus 公司; GENios Pro 多功能酶标仪，澳大利亚Tecan 公司; FACS Calibur 流式细胞仪，美国BD公司; BS214D 电子天平，德国Sartorius 公司;MCO-15AC 二氧化碳培养箱，日本Sanyo 公司。 　　1.2 细胞培养 　　A549，HCT116，HeLa 和SMMC7721 细胞培养于含有10%FBS 的DMEM 培养基( 高糖) ，置于37℃，5%CO2的细胞培养箱内培养，待细胞生长至80%融合时，用0.25%胰酶消化、传代，取对数生长期细胞进行以下实验。 　　1.3 SRB法检测肿瘤细胞存活率 　　1.3.1 C87 对肿瘤细胞存活率影响的检测 　　将处于对数生长期的A549，HCT116，HeLa和SMMC7721 细胞，消化后制成细胞悬液，调整细胞密度为A549 细胞5times;107 L-1，HCT116 细胞7times;107 L-1，HeLa 细胞5times;107 L-1，SMMC7721 细胞6times;107 L-1，每孔100 mu;L 接种于96 孔板内，培养24 h 后弃培养基，每孔加入用DMEM 培养基稀释的不同浓度C87 ( 终浓度0.05，0.1，0.25，0.5 和1 mu;mol·L-1 )100 mu;L，每组设3 复孔，对照组加入含0.1%DMSO的DMEM 100 mu;L，继续培养24，48 和72 h 后弃培养基，每孔加入10%TCA 溶液100 mu;L 固定细胞，4℃放置1 h，弃上清，用去离子水洗涤4 次。干燥后每孔加入0.4%SRB 溶液100 mu;L，室温下孵育30 min，弃上清，用1%醋酸溶液洗涤5 次。干燥后每孔加10 mmol·L-1 Tris 溶液( pH = 10.5) 100mu;L溶解，低速摇床上振荡10 min，酶标仪562 nm 波长下处测定各孔吸光度( A562 nm) 。细胞存活率( %) =( 实验组A562 nm -空白孔A562 nm) /( 对照组A562 nm -空白孔A562 nm) times;100%。 　　1.3.2 抗氧化剂对C87 抑制肿瘤细胞存活影响的检测 　　将处于对数生长期的HCT116 细胞经消化后制成细胞悬液，调整细胞密度为7times;107 L-1，每孔100 mu;L接种于96 孔板内，培养24 h 后弃旧培养基，一组中每孔加入含有抗氧化剂NAC ( 5 mmol·L-1 ) 的DMEM 培养基100 mu;L 处理30 min 后，加入用含有NAC( 5 mmol·L-1 ) 的DME