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细说敏煎对免疫性不育雄性小鼠的作用及研究 　　男性免疫性不育是指以精子作为抗原，在体内激发免疫反应所引起的不育症。夫妇婚后同居一年以上，未用任何避孕措施，男方性功能及射精功能正常，在至少一份精液样本中，gt;50%的活动精子被抗体包裹时，可以诊断为免疫性不育症。高效特异的治疗男性免疫性不育的方法目前尚缺乏，现代医学常用肾上腺皮质激素、抗生素、避孕套隔离法、防凝法和人工受精等方法治疗，其效果并不令人满意。近年来我们运用经验方“脱敏煎”治疗该病，取得了满意的临床效果。但是脱敏煎干预该病的具体作用机制，至今尚未明确。因此，本课题拟通过观察脱敏煎对实验性免疫性不育小鼠AsAb及TGF-p1, bcl-2表达的影响，揭示脱敏煎干预免疫性不育的一种可能机制，为免疫性不育的临床治疗及新剂型的开发应用奠定理论基础。 　　1实验材料与方法 　　1. 1实验 　　动物清洁级8周龄昆明种雄性小鼠110只，体重(25士3 ) g.购自浙江中医药大学动物实验中心。饲养条件:温度18?C，相对湿度50%换垫草。 　　1. 2实验试剂 　　精子抗体酶联免疫测定(ELISA)试剂盒，购自温州伊利康生物技术有限公司;M199获能液;完全福氏佐剂。 　　1. 3实验药物 　　1.3.1脱敏煎水煎剂:将脱敏煎组方药物(女贞子15g、黄琴12g、徐长卿15g、牡丹皮15g,百合lOg、丹参30g、防风lOg)每剂水煎2次，临用时用蒸馏水制成低、中、高三种不同的浓度，分别含生药O.lg/ml, 0.2g/ml, 0.4g/ml的煎剂备用。 　　1.3.2醋酸强的松片:由浙江仙据制药股份有限公司生产，批号:110621。临用时研末用蒸馏水配成0. 5mg/ml的混悬液。 　　1.3.3生理盐水。 　　1. 4实验仪器和设备 　　外科手术器械(浙江中医药大学动物实验研究中心提供);电子天平 (上海天平仪器厂);石蜡切片机(德国Leica公司);自动脱水机(英国Thereto shandon公司);BMJ-III型包埋机及冷冻台(江苏先锐医疗器械公司);GNP-9080型隔水式恒温培养箱(上海精宏医疗设备有限公司);DHG-9140A型电热恒温干燥箱(上海精宏医疗设备有限公司);Leica HI120型摊片机(德国Leica公司);BX20型荧光显微镜摄像机(日本OLYMPUS公司)。 　　1. 5实验方法 　　1.5.1模型的建立将雄性小鼠普通饲养一周以适应环境，并经观察无异常后，随机取10只作为正常对照组，参照张淑芹等方法。每次免疫前取8周龄雄性昆明小鼠8只，急性断头处死后取双侧附肇，用生理盐水冲洗，置于lOm1Ml99获能液中，剪碎，37℃静置15min，尼龙网(孔径200微米)过滤，37℃培育1. 5h，调精子数为2. 0 X 106/ml，加入完全福氏佐剂lOml,研磨混匀作为抗原。另取60只小鼠采用同种异体抗原进行主动免疫，复制免疫性不育小鼠模型。给造模组小鼠双侧腹股沟颈背部脊柱两侧皮下多点注射0. 5m1抗原作为首次免疫，lOd后于上述相同部位加强免疫，对照组注射生理盐水。分别于初免前及每次加强免疫后断尾采血，分离血清，ELISA法检测血清AsAb。第3次加强免疫后观察共有58只小鼠血清AsAb为阳性。 　　1.5.2动物选择与分组小鼠造模前随机取10只作为正常对照组，并将58只AsAb阳性雄性小鼠按随机数字表法随机分为模型组11只、醋酸强的松组11只、脱敏煎低剂量组12只、脱敏煎中剂量组12只、脱敏煎高剂量组12只。 　　1.5.3给药方法造模完成后，正常组和模型组均予以生理盐水，按1m1/1008体重灌胃;其余各组灌胃相应药液，均按1m1/1008体重灌胃。各组动物，无论给药或生理盐水，均每日一次，普食喂养，自由饮食饮水，连续30天。1.5.4标本的采集血清制备:分别于灌胃给药第10天、第20天、第30天断尾取血10uL，通过离心机将血液按3000r/min离心10分钟。1.5.5血清AsAb检测:分别于灌胃给药第10天、第20天、第30天上午9点钟，断尾取血IOC L，分离血清，用EL工SA法检狈l血清AsAb; TGF- I。、bcl-2表达的检测:运用免疫组化方法检测TGF- I，、bcl-2的表达:阳性反应为棕黄色颗粒。 　　1. 6统计学处理 　　用SPSS17.0统计软件完成，根据数据性质分别采用方差分析、卡方检验。Plt;0.05为差异具有显著性，Plt;0.01表示差异有非常显著性。 　　2结果 　　2. 1小鼠存活情况 　　脱敏煎中剂量组小鼠有1只在实验过程中因灌胃不当死亡