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试论基因编辑技术及其引发的伦理问题 　　试论基因编辑技术及其引发的伦理问题 　　1 从细菌的获得性免疫说起 　　1. 1 CRISPR 的发现1987 年，科学家在研究细菌的序列时，发现细菌的DNA 分子中有许多间隔的序列，其被重复的回文序列( 21 ～ 37bp) 隔开。到2002 年，科学家通过计算机分析，发现很多原核生物( 真细菌和古细菌) 的基因组都有类似的结构，将其命名为CRISPR( clustered regularly interspaced short palindromic repeats，即，成簇的、规律间隔的、短回文、重复序列) 。 　　在这些CRISPR 附近还有一类联合基因，这些基因表达的蛋白质称为Cas 蛋白，这些Cas 蛋白可与CRISPR 转录出的RNA 结合，形成核糖核蛋白复合物( 即CRISPR/Cas 复合体) ，具有切割和整合外源DNA 片段的作用。一个完整的CRISPR/Cas 系统包括5#39;端的tracrRNA 基因、中间一系列Cas 蛋白编码基因和3#39;端的CRISPR 基因座三部分结构，后者由引导序列( 具有启动子的功能) 、众多的间隔序列和重复序列顺序排列组成。 　　1. 2 细菌的获得性免疫当外源DNA 侵入细菌细胞时，CRISPR/Cas 复合体识别入侵DNA 中的原间隔序列附近的毗邻基序( PAM) ，将外源DNA 片段的原间隔序列剪切成间隔序列，并整合进两个重复序列之间，形成记忆。当细菌第二次受到相同外源DNA 入侵时，CRISPR基因座首先被转录成前体CRISPR RNA ( pre -crRNA) ，然后在Cas9 蛋白和核酸内切酶Ⅲ的作用下被剪切成一些小的RNA 单元，这些小RNA 即为成熟的crRNA，它由一个间隔序列和其两侧的重复序列组成。然后crRNA 和tracrRNA 结合，形成tracrRNA∶ crRNA 复合分子，并在Cas9 蛋白的协助下，使原间隔序列与crRNA 序列配对，由此识别出外源DNA 的PAM 序列。同时，Cas9 蛋白发挥核酸酶的功能，将入侵的外源DNA 分子剪切掉。而细菌自身的间隔序列，由于没有PAM 序列，因而不会被剪切掉。 　　由此可见，原核生物的这种防卫外源DNA 的方式，类似于人体内的获得性免疫: CRISPR/Cas 系统赋予了原核生物对外源DNA的记忆性和特异性。外来的间隔序列是高度可变的，不同的间隔序列代表入侵的不同外源DNA，可以是病毒的，也可以是质粒或其他外源DNA 分子。2 CRISPR/Cas 基因编辑技术及其应用从上述CRISPR/Cas 系统的作用原理可以看出，CRISPR/Cas 系统与限制性核酸内切酶相似，它对序列的特异性切割主要依赖于crRNA 与Cas 蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的PAM 以及原间隔序列。根据这一特性，科学家将其设计成人工的限制酶，用以对感兴趣的基因位点进行切割修饰。目前发现的3 类CRISPR/Cas 系统中，Ⅱ型系统的核糖核蛋白复合物相对简单，除crRNA 和tracrRNA 外，只有一个Cas9蛋白。 　　2 CRISPR/Cas 基因编辑技术及其应用 　　从上述CRISPR/Cas 系统的作用原理可以看出，CRISPR/Cas 系统与限制性核酸内切酶相似，它对序列的特异性切割主要依赖于crRNA 与Cas 蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的PAM 以及原间隔序列。根据这一特性，科学家将其设计成人工的限制酶，用以对感兴趣的基因位点进行切割修饰。目前发现的3 类CRISPR/Cas 系统中，Ⅱ型系统的核糖核蛋白复合物相对简单，除crRNA 和tracrRNA 外，只有一个Cas9蛋白。要 实现CRISPR/Cas9 系统对真核生物基因组的定点修饰，只需要满足两个条件: 一个Cas9 蛋白，一条向导RNA( gRNA) 。向导RNA 由两部分组成: 一段约20个碱基的RNA 片段( 相当于crRNA) ，此片段可以和定点修饰的靶标基因配对; 另一段为60 个碱基的RNA片段( 相当于tracrRNA) ，此片段对激活Cas9 蛋白是必需的。针对要修饰的靶标基因( 如某种致病基因) ，设计好crRNA 的序列，然后将Cas9 基因和gRNA 基因重组到质粒中，将重组质粒导入受体细胞内，就能实现对特定靶标基因的修饰改造。Cas9: gRNA 核糖核蛋白复合体相当于人工限制性核酸内切酶，只不过其特异性切割的靶标序列可以人为地设计。当受体细胞的靶标序列被切开后，会激活细胞内的DNA 修复机制，通过精确的同源重组修复机制或非同源重组的末端连接修复机制，就能实现外源正常基因的定点插入，从而达到替换致病