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谈响应面法优化火棘总酚含量测定方法 　　火棘[Pyracantha fortuneana ( Maxim. ) Li]为常绿灌木或小乔木，主产于川、滇、黔、陕、鄂、湘、粤、桂、闽、浙、皖、苏等我国南方山区及丘陵地带，资源极其丰富，目前已被国家卫生部批准作为食品新资源食用果品。其果实富含多酚成分，植物多酚具有抗氧化、抗肿瘤，延缓衰老、免疫调节等多种生物活性。目前用于植物多酚的含量检测方法较多，主要有分光光度法、近红外光谱法以及色谱法等。其中分光光度法因对设备的要求不高，操作简单而得到最广泛应用。主要包括酒石酸亚铁比色法、福林酚比色法和高锰酸钾滴定法等，其中福林酚法应用最为广泛。但不同资料所报道的用于总酚测定的福林酚比色法检测条件却存在很大的差异，主要表现在: ①最大检测波长不一致，有以680、725、740、750、760、765、780 nm 等为测定波长; ②福林酚试剂与碱液Na2CO3含量及比例各不相同，有1∶ 1、1∶ 2、1∶ 3 及1∶ 5 等; ③Na2CO3溶液浓度差别很大，有5% ( w /v) 、7. 5%、10%、15%、20%、饱和浓度等; ④显色时间分布在30 ～ 120 min等; ⑤显色温度20 ～ 60 ℃不等。因此很有必要对影响福林酚显色的因素进行系统考察，以确定最优检测条件。目前对火棘中多酚化合物的定量测定方法尚未见报道。为了更好地开发利用火棘植物中的功效成分，本文通过响应面优化建立了福林酚比色法检测火棘总酚含量的定量方法，此方法也可推广应用于其它植物总酚的含量测定。 　　1 材料与方法 　　1. 1 材料与设备 　　Lambda 25 型紫外-可见光分光光度计( 美国PE公司) ，CR 22G 高速冷冻离心机( 日本HATACHI 公司) ，Molelement1018a 型摩尔超纯水机( 上海摩勒科学仪器有限公司) ，万分之一电子天平( 德国赛多丽斯公司) ; 高速万能粉碎机( 天津市泰斯特实验设备有限公司) ; HSJ 系列恒温水浴搅拌器( 金坛市科析仪器有限公司) ; STARTER 2100 实验室pH 计( 奥豪斯仪器有限公司) 。没食子酸标准品( 中国药品生物制品检定所，批号: 110831-201403) ，福林酚试剂( sigma 公司) ，碳酸钠、乙醇等均为国产分析纯。火棘果，2014 年11 月中旬采自湖北恩施来凤地区，经华中科技大学植物学博士杨悦鉴定为全缘火棘Pyracantha atalantioides 的果实。 　　1. 2 实验方法 　　1. 2. 1 火棘多酚提取物的制备 　　取干燥、粉碎过20 目筛的火棘果粉末20 g，加体积分数45%乙醇200 mL 于92 ℃冷凝回流提取2 h，减压抽滤，滤液定容于200 mL，浓度以火棘干物质质量计为100 g /L，离心，收集上清液0 ～4 ℃冷藏备用。 　　1. 2. 2 火棘多酚的测定 　　取1. 2. 1 中稀释100 倍后的火棘多酚提取液1mL，加入0. 4 mol /L 福林酚试剂5 mL，混匀后，再加入170 g /L 的Na2CO3溶液1 mL，补充双蒸水至总体积为10 mL，混匀( 后续试验均依照此体系执行) ，于25 ℃避光恒温水浴反应1 h，冰水冷却，室温条件下于765 nm 波长处测定吸光度。 　　1. 2. 3 最大吸收波长的确定 　　取适宜浓度的火棘多酚提取液及没食子酸标准品溶液各1 mL，参照1. 2. 2 显色反应后，室温条件下于200 ～ 900 nm 全波段扫描，以确定最大吸收波长。 　　1. 2. 4 反应体系的确定 　　以10 mu;g /mL 没食子酸标准品溶液1. 0 mL 作为研究对象，确定福林酚法检测总酚含量的最佳反应体系。分别考察了福林酚试剂的浓度( mol /L) 及用量( mL) 、Na2CO3溶液的浓度( g /L) 及用量( mL) 、水浴时间( min) 及温度( ℃) 对总酚含量测定的影响以及火棘总酚溶液体系pH 值及火棘总酚提取液中乙醇体积浓度( %) 等因素对火棘总酚含量测定的影响。影响火棘多酚含量测定的单因素考察。 　　1. 2. 5 影响火棘多酚含量测定的单因素考察 　　在1. 2. 4 的基础上，确定多酚检测的反应体系为V待测溶液∶ V福林酚试剂∶ V 碳酸钠溶液= 1∶ 5∶ 1，以此反应体积比为模板，继续深入探讨福林酚试剂及Na2CO3溶液的浓度、水浴时间及温度、火棘总酚溶液体系pH 值及火棘总酚提取液中乙醇体积浓度对火棘多酚测定的具体影响。 　　1. 2. 6 响应面优化实验 　　在1. 2. 5 项的基础上，以吸光度为评价指标，固定待测溶液及反应体系，确定福林酚的浓度为0.