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谈烟草NtWRKY40 在植物应答病毒侵染过程中的作用 　　烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和马铃薯Y 病毒(Potato virus Y，PVY)均为RNA 病毒，寄主广泛，可危害烟草、马铃薯、番茄和辣椒等多种茄科作物，造成巨大经济损失。WRKY(WRKY transcription factors，WRKYTFs)等多种转录因子参与植物对生物逆境的防卫。WRKY 转录因子的氨基端包含保守的WRKY结构域，该结构域约含有60 个氨基酸，由1 个七肽WRKYGQR 序列和一个锌指结构组成，WRKY 结构域能够与靶基因启动子上的W-box 元件[(C/T)TGAC(C/T)序列]特异性结合，实现对靶基因的调控作用。根据WRKY 结构域数目和锌指结构特征，将WRKY 转录因子家族分为类型 I、IIa +IIb、IIc、IId + IIe 和III。在拟南芥中的研究表明，WRKY40 是一个负调控植物白粉病抗性的转录因子，它的表达会抑制抗病信号通路EDSl 和抗病物质亚麻荠素(camalexin)的合成。在烟草中过表达苜蓿的WRKY 基因，能够显著诱导NtPR2(endo-1，3-beta-glucanase)基因的表达，增强转基因烟草对烟草花叶病毒抗性反应。在烟草中，WRKY8与植物的免疫相关，WRKY3 和WRKY6 参与JA(茉莉酸)信号调控的防御反应，将这两个基因单独或同时沉默，茉莉酸的合成显著下降，加重烟草天蛾的侵害。也有报道指出，烟草的WRKY1和WRKY2 基因能够迅速响应机械损伤和真菌侵害。研究表明，病原物相关分子模式触发的免疫(PTI)和效应子触发的免疫(ETI)可以诱导大部分WRKY 转录因子在转录水平上的表达，例如烟草的WRKY7、8、9、11。我们曾发现，当烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、马铃薯Y 病毒(Potato virus Y，PVY)和黄瓜花叶病毒(Cucu-mbermosaic virus，CMV)侵染普通烟草后，烟草幼叶的一种WRKY 基因的表达激增。因此，进一步研究该基因在烟草应答病毒侵染过程中的作用，对阐明植物抗病信号转导途径及其作用机制具有重要作用。 　　近年来发展的人工miRNA(artificial miRNA，amiRNA)的技术，以生物体内源miRNA 前体作为天然骨架，以人为选定的靶基因的特定片段取代天然miRNA 成熟序列，构建amiRNA 以达到抑制生物体内靶基因表达的目的，实现特定基因的沉默，特别是用于共同抑制多个基因的表达。这种技术以其特异性、高效性受到了普遍的关注，在动植物代谢工程、生长发育调控以及抵抗外源病毒等方面起着重要的作用。但是由于难以明确所有amiRNA 在体内都能按预期被加工产生而具有显著的抑制功能。因此，有必要对相关因素进行进一步的研究。为此，本研究在克隆获得NtWRKY cDNA 之后，建立该基因过表达转基因烟草，并以TMV 为毒源，以明确该基因在烟草应答病毒侵染过程中的作用。此外，为探索应用人工miRNA 的抗病毒技术，以烟草天然miR167e 前体为骨架、PVY 病毒外壳蛋白基因的一段反向互补序列为成熟序列，构建35S 启动子驱动的植物表达载体35S∷amiRNA-PVY 并转化烟草，以抑制PVY 病毒，旨在为植物基因表达的调控及其应用技术提供科学依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 植物材料 　　实验所用烟草品种为云烟 85，为本实验室培养的无菌苗。 1.1.2 病毒材料 　　烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯Y 病毒普通株系(PVYO 系)繁殖并保存于云烟草85 上，由安徽农业大学江彤副教授提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 DNA 提取烟草叶片 　　DNA 的提取采用CTAB法，DNA 样品经RNase I 酶(TaKaRa)处理以去除RNA 污染。DNA 浓度用NanoDrop 2000 超微量分光光度计(Thermo)测定。 　　1.2.2 RNA 提取及cDNA 　　的合成烟草叶片总 RNA(Total RNA) 和小RNA(Small RNA)提取分别使用RNAiso Plus 试剂盒(TaKaRa) 和RNAiso Plusfor Small RNA 试剂盒(TaKaRa) 并按使用说明提取。总RNA 样品经DNase I 酶(TaKaRa)处理以去除DNA 污染。RNA 浓度用NanoDrop 2000 超微量分光光度计(Thermo)测定，RNA 的完整性通过1% 琼脂糖凝胶电泳检测。cDNA 第一链合成分别使用PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa) 和