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兔膝关节软骨细胞的分离提取与培养 　　【摘 要】在组织工程发展中，软骨组织因其成分简单首先被研究用来做体外组织工程软骨的构建。但由于自体软骨组织取材小，获得活细胞数量较少，且体外培养软骨细胞易发生“去分化”现象，限制了其后期应用。本实验在前人研究基础上，优化提取方法，获得大量活性好、增殖能力强的软骨细胞；并且发现在培养基中添加HEPES液、非必需氨基酸、脯氨酸以及抗坏血酸后，软骨细胞的贴壁及增殖能力明显增强。 　　【关键词】软骨细胞 提取 培养 　　软骨细胞作为软骨组织在软骨基质中唯一存在的特定的细胞种类，在软骨组织再生与代谢方面起到了重要作用。但因软骨组织中缺少血管和神经系统，其自身修复方面存在一定的局限性。近些年，生物组织工程学将工程学和生命科学的方法原理相互结合构建人体组织或器官的功能替代物。在软骨组织工程中，体外构建的自体软骨细胞组织复合物可移植到机体受损关节修复其结构并恢复原有功能。自体软骨组织移植技术已引起人们越来越多的重视，但由于机体软骨组织中的软骨细胞相对较少，无法满足机体受损关节修复和愈合所需的软骨细胞数量；并且软骨细胞在体外扩增的过程中，会发生“去分化”现象。发生了去分化现象的软骨细胞则不宜再用于软骨组织工程。因此，本实验通过结合国内外文献，试图探讨通过简易的方法来获取大量活性化、增殖能力强的软骨细胞。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验动物和试剂 　　2月龄新西兰大白兔1只（由苏州大学动物实验中学提供），体重1.5kg。II型胶原酶（collagenase type II）、HEPES液、脯氨酸、抗坏血酸及非必须氨基酸均由Sigma公司提供；高糖DMEM、PBS从Hyclone购买；胎牛血清、青链霉素由Gibco公司提供；cck8试剂购自国产碧云天。 　　1.2 软骨细胞的分离和培养 　　耳缘静脉空气栓塞法处死新西兰兔，75%酒精消毒双侧膝关节。将关节以及周围肌肉组织完全离断，75%医用酒精浸泡消毒后，放入含有双抗的PBS液中。在超净台上分离关节，剔除周围的软组织。仔细清除软骨表面的滑膜，用刀片削下透明软骨，放入含2ml PBS的5ml EP管中，并用PBS清洗3次。去掉PBS后，加入4ml 0.2%II型胶原酶，并移入15ml离心管中，放入37℃恒温摇床振荡消化。消化过程中，观察到约3h，软骨组织已全部变为絮状。将细胞悬浊液经过200目滤网过滤，收集到的软骨细胞分别按2000个/孔接种于96孔板、5000个/cm2接种于25cm2培养瓶。在37℃、5%CO2培养箱中培养。每天于倒置显微镜下观察细胞生长情况，并每3天换液一次。 　　1.3 软骨细胞培养液的组成 　　对照组：高糖DMEM培养基，添加10% FBS和1%双抗。实验组是在对照组的基础上，添加0.1mM非必须氨基酸、10mM HEPES液、0.4mM脯氨酸、50mg/L抗坏血酸。 　　1.4 原代软骨细胞贴壁和增殖情况 　　（1）细胞贴壁情况：原代细胞接种24h后，每天于倒置显微镜下观察贴壁生长情况并拍照。 　　（2）cck8法检测细胞增殖：原代细胞按2000个/孔的密度接种于96孔板，设5个复孔，接种后1-10d每天测得其吸光值（OD490）。测定前每孔加入10ul cck8溶液，放置培养箱继续培养。2h后于酶标仪检测OD490。 　　2 结果 　　2.1 原代软骨细胞的贴壁情况及形态学观察 　　原代软骨细胞接种后，分别按实验组和对照组的培养基进行培养，连续观察7d。原代分离的软骨细胞为圆球形，悬浮于培养基中；实验组，24h后细胞开始贴壁，逐渐展开，第3天时细胞基本均已展开呈多角形，在增殖过程中，出现抱团现象，至第6天，细胞可长满瓶底，单层生长的细胞呈现典型的“铺路石”样表现；而对照组的细胞，在48h才开始贴壁，第4天细胞基本展开呈多角形，第7天时呈现“铺路石”样。 　　2.2 原代软骨细胞的增殖情况 　　通过cck8法检测了实验组和对照组细胞连续9d的增殖情况。实验组的细胞在接种第2天即开始增殖，而对照组的细胞从第4天才开始明显增殖，实验组细胞的增殖率明显高于对照组。 　　3 讨论 　　随着社会快速发展，人口老龄化的问题日趋严重，伴随而来的关节软骨损伤的发病率也出现持续升高。因软骨组织缺乏血液和神经供应，其自身修复能力较差，故软骨损伤的治疗问题一直是医学界的研究热点。近年来，软骨组织工程技术已成为治疗关节软骨缺损的重要手段，而足够数量的高质量种子细胞的来源则是组织工程软骨构建的关键。 　　本研究在软骨细胞的消化分离过程中，清除软骨表面的滑膜组织后，采用对细胞毒性较小的0.2% II型胶原酶消化，可以减轻胰酶对软骨细胞的伤害。置于37℃恒温摇床振荡，可以在较短时间内使软骨消化更彻底。本实验中，