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生物技术实验心得体会 基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术：目的基因的获得 、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。 可概括为∶分、切、连、转、选。分是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；切是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；连是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；转是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；选则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。 PCR方法 PCR 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方采用DNA合成仪，对目的基因进行分段合成，然后进行连接，可以得到所需的目的基因。 DNA体外重组是将目的基因在DNA连接酶作用下，连接到合适的载体DNA上，以便下一步转化之用。～～ 三、重组分子的扩增和鉴定 重组DNA分子导入受体细胞 目的基因和载体在体外连接形成重组DNA分子后，需要被导入受体细胞中才能进行增殖和（或）表达。受体细胞是重组基因增殖的场所，所以对受体细胞也应具有几点要求：①容易接纳重组DNA分子；②对载体的复制扩增无严格限制；③不存在特异的能降解外源DNA的内切酶体；④不对外源DNA进行修饰。一般将重组DNA分子导入原核细胞的过程称为转化，而导入真核细胞的过程称为转染。将重组DNA分子和感受态大肠杆菌细胞相混合，使重组DNA分子进入大肠杆菌中，就可以实现重组DNA分子的转化。 重组DNA分子导入受体细胞后是否得到扩增，扩增后的重组DNA分子是否正确，导入的重组DNA分子是否含有正确的插入片段，重组DNA分子能否表达插入的目的基因，一般可以采用X-gal方法对重组DNA分子进行鉴定。 OD值调整培养时间。 接种的试管、三角瓶等应做好标记，注明菌种、日期、组别、姓名等。 6、大肠杆菌感受态细胞制备及转化: 所有操作均应在无菌条件和冰上进行。 所使用的器皿必须经过灭菌。并且要防止迹量的去污剂或其它化学物质、杂菌、DNA酶或杂DNA所污染，否则会大大降低细菌的转化效率。 注意转化的质粒 DNA 的质量和浓度。当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。 实验所用的溶液最好用3次蒸馏水配制。 7、筛选重组转化菌落: 在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。不是一开始就4℃，是等菌长出来之后。一般菌长出来就会有蓝色的了，4℃之后会进一步显色。 当出现蓝斑较大，白斑很小附在周围，还有蓝白镶嵌的斑即卫星菌落的时候，可以小心挑取中间的那个菌落，有可能是阳性克隆。 要注意培养时间不宜过长，出现阳性菌落就及时处理，以12-16小时为宜。 培养基中加抗生素的时候，温度不能高了，不烫手为宜，防止抗生素失效。 8、菌液PCR分析: 注意移液枪正确的使用方法，各种量程的调试，一般以接近最大量程的为准。 9、取大肠杆菌重组质粒DNA和酶切分析 《质粒小量提取试剂盒》进行质粒的提取的第三步和第四步之间的时间，操作要流畅快速，决定了实验成败 禁止吸出沉淀 五、总结 在分子生物学中，基因克隆是一种常用的技术。其中关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。 基因工程是把双刃剑。如果不加节制的使用基因工程，让它去为你包治百病，那样你的整体免疫系统也将发生错乱，让你完全可以抵挡的疾病访问造成