生物大分子miRNA教材.ppt

荧光素酶报告系统 双荧光素酶报告基因测试∶ 结合萤火虫和海肾荧光素酶的共报告基因测试技术 多克隆位点 技术流程 获得miRNA对应DNA模板 扩增含有靶位点的3’UTR序列 靶序列克隆，构建到荧光素酶表达载体 PCR产物双酶切，连入同样双酶切的载体中，连接产物转化DH5α，阳性克隆鉴定。 荧光素酶活性检测 将miRNA mimics以及荧光素酶报告共转染，检测荧光素酶报告基因 将3’UTR靶位点的种子区进行点突变作为对照，使结果更严谨 实例： 实例： miRNA调节通路的检测 蛋白芯片 Western blot 实例： RNA干扰 RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指一种由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。 microRNAs (miRNAs)：mRNA翻译被抑制 short interfering RNAs (siRNAs) ：引起mRNA切割 干扰机制 miRNA简介 microRNAs（miRNAs）是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21－25个核苷酸组成。 通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑制调节基因的表达。 动物的靶序列在3’非编码区（3’UTR） 植物的靶序列在编码区或5’UTR miRNA生成 miRNA途径开始于一个miRNA基因的pri-miRNA（primary miRNA）转录本；这个70－100nt的发卡RNAs（pri-miRNA）在核内被核糖核酸酶Drosha加工处理而最终成为pre-miRNA（precursor miRNA） pre-miRNA被核输出蛋白exportin 5转运入胞质，接着被第二个核糖核酸酶Dicer消化为21－25nt的miRNA；这个阶段的miRNA可以结合RISC（RNA-Induced Silencing Complex）并与靶标mRNA互补 图例 miRNA研究流程 miRNA的筛选 深度测序 抽提分离小分子(例如18-30nt)RNA，通过RT-PCR扩增之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析，获得miRNA表达谱。深度测序结合生物信息学分析手段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的miRNA(miRNA-known)、新的miRNA(miRNA-new)以及可能的新miRNA(miRNA-cadidate new)，并对新发现的miRNA进行靶基因分析，功能预测等。 miRNA芯片 利用miRNA芯片，可以高通量分析miRNA表达的时空特异性、不同样本(例如癌组织和癌旁组织)中miRNA的差异表达，寻找在生物学功能上起作用的miRNA 实例： miRNA表达检测 目前检测miRNA的技术主要有以下几种： Northern杂交 原位杂交 微点阵（microarray） 实时定量PCR Northern杂交 实例： 原位杂交 实例： 实时定量RT PCR Loop反转录法 每次RT只能检测一个miRNA 特异性高 多个样本中检测同一miRNA polyA加尾法 一次RT可检测所有miRNA 通用性高 适合miRNA高通量检测 引物设计 1.通常情况下，Forward Primer序列与待测miRNA序列基本一致，只要将原有的U替换成T即可。 例如： 2.在特殊情况下，例如当miRNA分子中GC含量偏高时，可在miRNA序列3’端减少3~4个碱基，从而降低引物的Tm值；相反，如果miRNA分子中GC含量偏低时，可在miRNA序列5’端添加几个GC碱基，从而提高引物的Tm值。例如： *1 OLIGO: Primer Analysis Software。 *2 Primer3: （/ftp/distribution/software/） *3 /BLAST/ 实例： miRNA功能研究 用特定试剂改变内源miRNAs的水平，观察靶mRNA及编码蛋白的表达，进行信号通路研究 功能获得研究：把miRNA导入细胞 miRNA mimics：化学方法合成的miRNA模拟物 miRNA 表达克隆 功能缺失研究：抑制miRNA表达 miRNA inhibitor miRNA抑制剂表达克隆 过表达miRNA 将miRNA mimics转染到细胞中，能实现miRNA瞬时过表达 构建miRNA表达载体可进行长期研究 过表达载体中有插入成熟miRNA、pre-miRNA及pri-miRNA序列三种形式 载体选择有三种：慢病毒，腺病毒，质粒 抑制miRNA miRNA 抑制剂克隆导入细胞后表达的miRNA抑制剂(miArrest)特异地结合它们的靶miRNA，形成稳定的复合物，阻止了miRNA对靶标mRNA的降解或者翻译抑制，上调miRNA靶标基因的表达 化学