亲和超滤耦联液相色谱-质谱快速检测山楂叶中的α-淀粉酶抑制剂.pdfVIP

第41卷 分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究报告 第 2期 2013年2月 ChineseJournalofAnalyticalChemistry 229～234 DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．20558 亲和超滤耦联液相色谱．质谱快速检测 山楂叶中的 -淀粉酶抑制剂 陶 益 陈 锥 张玉峰 (浙江大学药物信息学研究所，杭州 310058) 摘 要 建立了用于快速检测山楂叶中 一淀粉酶抑制剂的生物亲和超滤方法。考察了磷酸盐缓冲液的pH 值、离子强度、孵育时间、孵育温度 、一淀粉酶浓度等影响亲和超滤的因素，最终选择了10mmolL／磷酸盐缓冲 液(pH74)作为孵育溶液 ，在 37℃孵育45min，淀粉酶浓度为 10g／L。在优化条件下，将本法应用于山楂叶 总黄酮的d一淀粉酶抑制剂的筛选 ，得到3个活性成分 ，分别鉴定为槲皮素一3-0一鼠李糖基一(1— )一葡萄糖基．(1 — 珥)一鼠李糖苷、牡荆素_2一葡萄糖苷、牡荆素_2．鼠李糖苷。这3个化合物的 一淀粉酶抑制活性为首次报道。 关键词 亲和超滤；OL一淀粉酶；山楂叶 1 引 言 亲和超滤法是一种使用超滤膜把生物大分子 (10kDa的蛋 白或DNA)和小分子化合物分离的方 法。vanBreemen 在 1997年首先采用在线脉冲超滤．液质联用系统对组合化合物库进行筛选，选择 人血清白蛋 白和小牛肠道腺苷脱氨酶作为靶标，将混合物与靶标进行孵育，使用脉冲超滤法分离靶标蛋 白和混合物溶液，加入甲醇使靶标蛋 白变性释放结合的配体，最后使用质谱对结合配体进行鉴定。配体 解离常数在微摩尔级和纳摩尔级的化合物都能被该方法检测到，如人血清 白蛋 白的配体华法林、水杨 酸、呋喃苯胺酸、甲状腺素及小牛肠道腺苷脱氨酶的配体红．9．(2一羟基．3．壬基)腺嘌呤等。在新药的发 现过程中，脉冲超滤一液相色谱．质谱联用系统为组合化合物库的筛选提供了一种新的选择。 脉冲超滤一质谱筛选方法的主要步骤有 ：(1)化合物与靶标分子进行孵育；(2)超滤分离靶标和未结 合配体；(3)加缓冲液，清洗未结合配体；(4)加有机溶剂使靶标．配体复合物变性，解离出结合配体，用 液相色谱．质谱进行鉴定。研究者使用该筛选方法对一系列靶点 (如癌症靶点、周期检测点酶、抗感染 酶)进行了筛选 ，发现了很多先导化合物 。这种超滤方法的缺点是必须将未特异结合的配体清洗干 净，否则会影响结合配体的质谱检测。Sun等 使用比较亲和超滤法对雌激素受体的结合配体进行了研 究，避免了上述洗脱不干净的缺陷。 OL．淀粉酶抑制剂能有效地抑制肠道内胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，减少 糖分的摄取，降低血糖和血脂含量水平 ，在治疗糖尿病、减肥等药物开发方面具有光明的前景。此外 ， 一 淀粉酶抑制剂作为一种新的起保鲜、防腐作用的食品添加剂，在食品领域也有较广泛的应用嘲。目 前，已经发现的OL一淀粉酶抑制剂主要来源于植物和微生物，植物来源的OL一淀粉酶抑制剂主要是黄酮类 和酚酸类化合物[7]。山楂叶是蔷薇科植物山楂属植物山楂的干燥叶，其主要成分是黄酮类化合物如牡 荆素、荭草素、牡荆素 鼠李糖苷等化合物8[．。叶希韵等 叫研究了山楂叶总黄酮对糖尿病小 鼠血糖和血 脂等生化指标的影响，证明山楂叶总黄酮具有显著降低糖尿病小 鼠血糖和血脂的作用，并对糖尿病并 发症和肝脏组织脂肪积累具有一定的防治作用 。Wang等 1]也对 山楂叶黄酮提取物的血糖和脂质代谢 调节作用进行了研究，发现其能显著抑制小鼠对碳水化合物和甘油三酯的吸收。上述研究提示，山楂 叶总黄酮中可能存在着 OL一淀粉酶抑制剂 。为了筛选新的OL一淀粉酶抑制剂，本研究采用亲和超滤法，以 Or．一淀粉酶为靶点，对山楂叶总黄酮提取物进行筛选，通过比较加酶组和未加酶组的峰面积变化，观察到 3个峰面积降低的峰，经质谱鉴定分别为槲皮素一3—0一鼠李糖基-(1—4)一葡萄糖基一(1—珥)-鼠李糖苷、牡 2012-05-28收稿 ；2012-08-28接受 本文系国家新药