凝胶等电聚焦测定蛋白质等电点试题.ppt

聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质等电点张楠楠 一 目的 1 学习凝胶等电聚焦的原理 2 掌握圆盘聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳操作技术 3 测定出本实验条件样品的等电点 原理 等电聚焦（Isoelectric?focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。 凝胶等电聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 特点:在凝胶中加入一种两性电解质载体的化合物其可以使凝胶柱上产生pH梯度。把蛋白质样品放在这样的凝胶柱中进行电泳带电荷的蛋白质离子即在柱上泳动。当泳动至凝胶的某一部位时而此部位的pH正好相当于该蛋白质的pI时由于蛋白质在等电点时净电荷为0即不在移动测定聚焦部位凝胶的pH值 即是该蛋白质的pI. pH ＞ pI 蛋白质带负电荷 → 正极 pH ＜ PI 蛋白质带正电荷 → 负极 pH = pI 净电荷为O 不移动 等电聚焦（Isoelectric?focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。由瑞典科学家建立，利用蛋白质具有不同等电点在一个稳定 线性 连续的pH梯度中进行分析和分离。 近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。 本实验利用pH3~9的两性电解质载体在聚丙烯酰胺凝胶中形成一个稳定 连续 线性的pH梯度。在此梯度中进行不同pI的蛋白质等电聚焦, 随着电泳时间的增加，不同pI蛋白质都会停留在与各自pI相同的pH位置，不再移动，测定这些位置pH，即得到这些蛋白质的等电点pI。 ⒈ 溶解性好、缓冲能力强，能形成稳定的pH梯度 ⒉ 导电性能好 ⒊ 化学性质稳定，无毒、无生物学效应，不影响蛋白质活性 ⒋ 紫外吸收低，分子量小，与蛋白质可逆结合 易除去 两性电解质载体: 多羧基 多氨基的脂肪族化合物. 淡黄色的水溶液 40% 4℃ 商品有不同的pH范围供选择. 本实验的终浓度为多少? 本实验采用柱状聚焦电泳法进行 超薄层凝胶等电聚焦法 园盘状等电聚焦法 三 试剂与器材 1 凝胶储备液 30gAcr，0.8gBis纯水定容至100ml 2 10%AP 1克AP至10毫升 4 40%两性电解质载体（商品用品） 5 正极溶液: 1M磷酸溶液（2000ml/班） H3PO4(85 %)68ml，加纯水定容至1000ml 6 负极溶液: 1MNaOH溶液（2000ml/班） NaOH40g，加纯水定容至1000ml 7 固定染色液（1000ml/2班） : 10g三氯乙酸，0.5g考马斯亮蓝R250，定容至100ml(先溶解三氯乙酸，待颗粒溶解完全，加入考马斯亮蓝R250 ) 8 未知pI样品溶液: 5mg/ml 10ml 1. 凝胶柱的制备 配方如下: 凝胶液 2.5ml 40%Ampholine 0.5ml 蛋白样品 100ul TEMED 10ul 水 6.74ml 10%AP 0.15ml 2. 装管 每个学生装1支管，每组装六支（其中五只为）。将圆盘电泳槽的玻璃管洗净晾干，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂直放在试管架上，用胶头滴管将配好的胶液移入管内，（每根玻璃管的容量约为~2ml），液面加至距管口5mm处，用注射器轻轻加入少许H2O，进行水封，以消除弯月面使胶柱顶端平坦。胶管垂直聚合约50分钟，聚合完成时可观察到水封下的折光面。 3. 装槽和电泳 用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，调节好各管的高度，记下管号。每支管约1/3在上槽，2/3在下槽。上槽加入500ml 1M NaOH ，下槽加入500ml 1M H3PO4 ，