阿尔茨海默病小鼠模型海马组织AtP5a1基因甲基化改变.docVIP

阿尔茨海默病小鼠模型海马组织AtP5a1基因甲基化改变 　　[摘要]目的初步探讨中期阿尔茨海默病（AD）的presenilin-1/presenilin-2双基因条件性敲除小鼠（dKOmice）模型中海马组织Atp5al基因的甲基化改变情况。方法运用简化的表观亚硫酸盐测序技术（RRBS）检测3只12月龄雌性dKO mice和3只同系同龄雌性野生型小鼠海马组织基因组DNA异常甲基化情况，利用Bismark（v0.7.4）软件进行对照分析获取异常甲基化基因。结果二代测序结果显示12月龄中度神经退行性病变AD dKO mice海马中Atp5al基因呈低甲基化状态（P0.05）。结论Atp5al基因在中期ADdKO mice的海马中呈低甲基化状态，提示低甲基化的Atp5al基因可能作为参与中期AD病程的潜在候选基因。 　　[关键词]Atp5al基因；阿尔茨海默病；DNA甲基化；dKO inlce 　　阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种以进行性记忆障碍及认知功能减退为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病，典型病理改变是大脑皮层和海马细胞外主要由β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，A p）沉积形成的老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结。其发病机制复杂，涉及遗传因素、环境因素、成千上万个基因表达的改变及多种信号途径的调节，如Aβ的沉积、tau蛋白的过度磷酸化、氧化应激、炎症、能量代谢及细胞凋亡周期异常等。Mastroeni D等以同卵双胞胎作为研究对象，发现正常的和患AD的双胞胎尽管遗传基因相同，但是他们的表观遗传修饰却不同，AD患者的双颞侧皮层神经元中DNA甲基化水平显著低于正常的同卵同胎，而且，其发病年龄、临床表现和病程都相差很大。可见，表观遗传机制在AD的发病过程中扮演着十分重要的角色。 　　随着高通量测序技术的开展，AD相关基因的甲基化分析已经取得一些进展。本研究采用简化的表观亚硫酸盐测序技术（reduced representationbisulphite sequencing，RRBS）初步构建起了中期AD dKO mice海马组织基因组DNA甲基化图谱，从中发现Atp5a1基因呈低甲基化状态，可为后续进一步验证并探讨AD的表观遗传学机制提供潜在候选靶基因。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1实验动物 　　美国Ya-Ping Tang教授（Louisiana State University，USA）为本实验提供了亲代小鼠（基因型为fPSl/fPSl，PS2-/-，Cre+/-），其遗传背景为B6CBAFl，是利用Cre/loxP系统条件性敲除前脑presenilin-1（PS1）基因，所得杂合子与利用基因打靶技术将presenilin-2（PS2）基因进行全身性敲除所得杂合子杂交而来。子代dKO mice的饲养、繁殖与基因型鉴定等如我们已报道所述。实验分组：12月龄雌性dKOmice（体重=35.0±2.6g）和同龄雌性野生型小鼠（体重=37.0±1.8g）各3只用于RRBS测序检测。 　　1.1.2海马组织的准备（1）乙醚麻醉后快速断颈处死实验小鼠；（2）用组织剪剪开皮毛，暴露头骨；（3）更换剪刀拨开颅骨，暴露全脑；（4）用眼科剪剥离全脑组织，转移至放于碎冰上的无菌平皿中；（5）用手术刀沿矢状缝把左右半球分开，迅速分离海马组织，装入已标记好的冻存管中，用封口胶封口，置于液氮罐中约30min后，转入-80℃冰箱中保存。 　　1.2方法 　　1.2.1 DNA提取TIANamp DNA提取试剂盒（货号DP304）购自天根生化科技有限公司。提取海马组织基因组DNA主要步骤包括：（1）将组织处理成细胞悬液；（2）裂解：在变性条件下用蛋白酶K裂解样本；（3）吸附：DNA吸附于纯化柱中的硅胶膜上；（4）清洗：将硅胶膜上吸附的蛋白、脂质等杂质洗掉；（5）洗脱：利用洗脱液TE将高纯度的DNA从硅胶膜上洗脱。运用紫外分光光度计测量OD值（0D260/280和0D260/230）和0.8%琼脂糖凝胶电泳（100V，40min）进行DNA质量检测。 　　1.2.2RRBS测序将纯化后的DNA提交到杭州联川生物技术有限公司进行甲基化谱RRBS测序（Illumina HiSeq 2500）。RRBS测序原理：运用限制性内切酶MsPI处理基因组DNA，产生末端包含CpG二核苷酸的片段后，在末端修复并加A尾和接头，根据大小（40-220bp）选择CpG丰富DNA片段，经重亚硫酸盐处理及PCR扩增后使用Illumina基因组分析仪进行测序。测序完成后，采用NGSQCToolkit_v2.3软件进行测序数据的质量控制，将5%以上碱基质量数低于30的序列过