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新鲜生物样品的环境扫描电镜观察 何黎平黎军英 0029) (浙江大学分析测试中心，杭州31 应用高真空扫描电镜观察生物样品必须经过干燥和导电处理，但无论是采用冷冻干燥还是临 界点干燥，多少都存在着一个样品缩水问题，有的生物材料如真菌菌丝和孢子、水牛藻类、培养 细胞、昆虫胚胎及幼虫等经处理后会产生较大的变形，无法观察到生物体的原来面貌。植物花粉 虽然细胞壁较厚，比较容易进行扫描电镜观察，但水稻、大小麦及其他一些植物的花粉，由于其 细胞壁薄，难以得到不变形的真实电镜形态照片。环境扫描电镜(EnvironmentalElectron Scanning 于1～10Tort气压环境，且可以调节样品室的温度、气压和相对湿度。从样品激发出的二次电子 对周围气体发生电离，放大了原本较弱的电子信号，被气体二次电子检测器接收(图1)，同时 气体电离产生的正离子中和了样品表面积聚的电荷，使高加速电压下不会产生充放电现象。这样， 生物样品不进行任何处理就可以观察其原有的自然形态。 ESEM目前已在生物、医学、农业、材料化工、石油地质、食品、轻工等领域得到广泛应用 【3，…。近年来，我们应用ESEM观察研究了多种动植物组织、花粉、昆虫、食用菌、病原真菌、 水生藻类等新鲜含水样品，获得了较好效果，现报道一些应用实例。 1材料与方法 1．1制样方法： 产有红蜘蛛卵的植物叶片用刀片分割成合适火小，用导电胶粘在样品台上；杜鹃花粉直接粘 附在样品台的导电双面胶带上；培养在小麦叶片上的白粉病菌，连同口I-片用导电双面胶带粘在样 品台上。 1．2ESEM观察条件： 冷台温度选定为5℃，样品室气压5Tort左右，相对湿度约85％，加速电压为1}20kv。 1．3高真空sEM观察； 另外将杜鹃花粉粘台后进行喷金处理，将小麦自粉病菌样品进干亍常规固定、脱水、1Ifii界点干 燥、喷金处理，然后在高真空条件下进行观察，加速电压为15～20kV。 2结果与讨论 ESEM观察红蜘蛛卵呈光滑圆球形，表面无纹饰，也没有因脱水而引起的皱缩，卵表面被有 少量粘液(图l，2)。杜鹃花粉在常规高真空扫描电镜下呈局部凹陷的三角形结构，在许多花粉 图谱中均为这种形态；而在ESEMF清晰地显示为饱满的四台体复合花粉，排列成1粒在上，3 粒在下，花粉大小为50p．m，具3孔沟，外壁表面具细网状雕纹和细长的粘丝(图3，4)；当改 变样品室气压从4．8Tort至3tort时可以看到逐步收缩变形过程，最后呈现与高真空扫描电镜象 一样的形态(图5)，表明以往的杜鹃花粉形态是在因真空失水而形成的人工假象。小麦白粉病 菌采用锇酸熏蒸固定镀金或常规I临界点干燥处理，在高真空扫描电镜下菌丝和分生孢子均皱缩变 形(图6)，无法得到完整满意的图象。在ESEM下白粉病菌的菌丝、分生孢子梗和分生孢子均 保持了饱满的形态，菌丝分布在小麦叶片表面，产生吸器伸八小麦表皮细胞内吸取养分，分生孢 子梗从菌丝上垂直生长出米，其顶端的孢子母细胞向外不断分割形成串生的分生孢子(圈7，8)。 图1．气体二次电子检测器GSED的原理 图2．水的相态变化与扫描电镜工作区间对比(1Ton-=133Pa或0．75mhar) 在实验中我们感到ESEM适合多种高含水的生物样品观察，由于样品不作任何处理，重要 的结构保持在原位，结果更具真实性。ESEM的操作要求比较高，依据水的相态变化曲线(图2)， 水的相态变化随着气压和温度而升高，当温度为2．5℃左右，气压为5-7Torr，此时样品处在饱和 湿度下，因此只要控制好温度和气压，就可以灵活地使水分在样品表面处于凝结或蒸发状态，很 方便地观察湿润的新鲜样品，当然也可以观察样品的失水或凝水过程。 环境扫描电镜在我国各行业安装的台数逐渐增多，应用也越来越广，相信随着仪器的不断改 进，应用者的技术不断提高，ESEM将会在生命科学领域显现其独特的魅力，得到更广泛地应用。 参考文献 G D．Foundationofenvironmentelectron inElectronicsandElectron 【1】Danilatos