贻贝多糖对大鼠睾丸支持细胞增殖作用的研究.pdfVIP

疆毽I仃 第三届毫洋生物高技术论坛 2005．08．19-23 贻贝多糖对大鼠睾丸支持细胞增殖作用的研究 张建鹏’王俊徐红丽刘军华冯伟华木焦炳华 (第二军医大学生物化学与分子生物学教研室，上海200433) 摘要：为深入研究海洋生物多糖的药用价值，本文对贻贝多糖进行分离提取并就其对大鼠睾 丸支持细胞的增殖作用进行了研究。通过热碱法提取贻贝多糖粗品，过DEAE．cellulose柱获 得三个洗脱峰的半纯品，分别用双蒸水配成两种浓度的贻贝多糖溶液，然后用MTT法对其 进行了大鼠睾丸支细胞增殖率测定研究。结果发现，得到的贻贝多糖粗品呈白色粉末状，水 溶性好；贻贝多糖半纯品三个洗脱峰均能提高大鼠睾丸支持细胞的增殖率，其中，第三峰和 1mg／ml剂量的第二峰促细胞增殖作用明显．由此推断，贻贝多糖能有效提高大鼠睾丸支持细 胞活性，从而增强机体的免疫力、促进男性生殖细胞的发育． 关键词：贻贝多糖；分离纯化；睾丸支持细胞 研究发现，海洋生物多糖有着广泛的生物学活性，具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰 老、抗放射性、降血脂及抗病毒和抗菌作用【l~3】。目前，对海洋生物多糖的研究已经进入到 受体、分子水平，对阐明多糖的生物效应与立体构象及作用机理必将有重要意义。本室对东 海厚壳贻贝的免疫活性作用进行了深入研究。在此基础上本文观察了贻贝多糖对大鼠睾丸支 持细胞增殖作用的影响。随着研究的不断深入，海洋生物多糖的活性及机理必将日趋完善， 为海洋资源的开发利用打下坚实的理论基础。 1材料与方法 1．1材料 1．】．1新鲜厚壳贻贝由浙江省嵊泅市嵊山县提供；出生15天雄性SD大鼠由第_军医大学实 验动物中心提供。 I．1．2 DEAE-cellulose 52，Sephacryl biochemical 丁醇(中国医药集团上海化学试剂公司)；胶原酶(Worthingtoncorporation)；胰 酶(博大泰克)；HEPES(AMRESCO)。 1．2方法 1．2．1贻贝多糖粗制品f向制备及总糖量测定 贻贝多糖的提取分离：样品去壳，肉质剪碎，分别按每克鲜重组织加入0．02mol／L 7．2磷 pH 酸盐缓冲液3 h，1000 ml‘rJ：高速组织捣碎机中匀浆2min，412静置24rpm离心，收集上清 液。残渣再分别加入磷酸缓冲液浸泡24h，离心，合并2次上清液。抽提物冷冻干燥得干粉。 木通讯作者。Email：冯伟牛fwh402@163．com 319 疆藿lr】 第三屠海洋生鞠膏技术论坛 200s．08．19-23 将lg干粉加热溶解于200ml水中，纱布过滤， 除蛋白，加3倍体积乙醇过夜，得到白色沉淀，烘箱烘干，获贻贝多糖粗品。分光光度法测 总糖最。 1．2．2贻贝多糖半纯品的制备 取多糖粗品500mg溶解于10 NaCI、0．05mol／L 柱，分别以dH20、O．Olmol／L NaCI洗脱至无糖液流出【5】，流速40ml／h，分 部收集，硫酸一苯酚比色法跟踪检测，合并相同组分，透析除盐，乙醇沉淀，真空冷冻干燥 得半纯品多糖一A／BIC。 1．2．3大鼠睾丸支持细胞增殖实验 1．2-3．1细胞分离： 死，75％乙醇浸泡3min，摘取睾丸组织置预冷生理盐水中；细胞室超净台内去除睾丸被膜及 血管，将睾丸组织在玻璃平皿内用去少量预冷生理盐水(无Ca2+，M92+)反复冲洗2—3次； 用剪刀将睾丸组织剪碎，5ml预冷的生理盐水反复冲洗后移入小三角烧瓶内，吸去生理盐水； 加入5ml 振荡55min；小心吸出三角烧瓶中明显的团块(去除间质细胞)，剩余颗粒物质用生理盐水清 洗三次，加入0．01％胰蛋白酶5ml，作用15．20min；小心去除较明显的团块(去除