采用PCR法筛选牛BAC文库.pdf

反刍动物分子遗传与育种∞137 for of of microsatelliteBMl43infour breedscar!beevaluatedthe hy goats polymorphismspecies using genetic of breeds． it thecertaintheoreticbasiscomervationandutilizationof goats，and goat provided Keywords：Goat；MicrosateUite；Geneticdiversity 采用PCR法筛选牛BAC文库 阴层层①张勤② (中国农业大学动物科技学院，北京，100094) 摘要：以位于奶牛六号染色体(Bos船“，W 这些重叠群为增加此片段内的标记提供了基础。 关键词：BTA6；微卫星；BAC文库；PCR法 BAC文库即细菌人工染色体义库，它具有没有嵌合现象、稳定性好、易于分离插入片段、操作简单、 町采用高效的电转化体系等多个优点，凶此已成为构建基凼组大片段插入文库应用最广泛的系统，目前 已有多个畜种构建了BAC文库Ll。j_， 级池，经PCR扩增确定阳性克隆所在的超级池，将阳性超级池的每个板、每行、每列混合组成二级池的 板池、行池和列池，经PCR扩增可得到3个阳性信号(阳性板、阳性行、阳性列)，相互交义的信号即可确 的目的片段并对此做鉴定，然后用PCR法筛选BAC文库来构建重叠群。 1材料与方法 1．1试验材料 接到pBACe3．6载体上，感染DHIOB型大肠杆菌构建『『Ii成。共138 1．2试验方法 1．2．1 已知标记的筛选、扩增和鉴定 10×扩增缓冲液， 卫星及其引物序列见表l。对它们的PCR扩增条件为：反应总体积为25m，其中2．5ta 2td 北京鼎园生物技术发展L}_l心)，1出DNA模板(50～200,,g／一)，16．5ttl ①作者简介：阴层层(1979)，女，在读博士．研究方向动物分子遗传 ②通讯作者：张勤(1956)．男，教授，博导．研究方向动物分子数量遗传学E-mail：q小m％@删一-㈨n 138堕史圜垫塑堕焦壹壁墅窒堂垦 7min。我们着重对各标记的退火温度进行r优化，得到的最佳退火温度列于表1。 表1 7个已知标记的引物序列、最佳退火温度以及同源性 采用碱裂解法提取质粒DNA，并测序。 1．2．2PCR法筛选BAC文库 在BAC文库超级池的每个孔中加50／t1ddH：o使其溶解，以已知的7个标记为引物，以所有的超级 池为模板进行两次的PCR扩增，反应体系和程序同上，若能扩增出目的片段则说明该超级池为阳性超 级池，再以阳性超级池为模板进行三次PCR扩增来验证阳性超级池。定购所有阳性超级池所对应的二 级池并在每个孔中加50ral 增。再以阳性板池、行池、列池为模板，作三次PCR扩增来验证阳性克隆。以得到阳性克隆为模板做两 次菌体PCR进行验证。 2结果和讨论 2．1鉴定已知标记 到的序列进行同源性分析，结果如表1所示。 的N，所以并非所有比对的结果都是100％的同源，但仍可以确定我们所扩增出的片段和已知片段是相 同的。 2．2 BAC文库的筛选结果 PCR法是一种快速简便的从大量的BAC文库单克隆中筛选出阳性克隆的方法18J。与传统的杂交 2