现代遗传学14.遗传工程学幻灯片.pptVIP

第十四章 遗传工程 利用转基因手段对生物进行人为改造的技术 什么是遗传工程？ 体外DNA重组技术：利用工具酶将外源片段和载体连接，导入生物体并使其稳定复制和传代的技术 目的 研究工作 生物产品(生物反应器) 改良物种(提高品质) 基因治疗 工具酶 A. 剪切酶类 有目的有选择的把目的片段切开 B. 连接酶类 将目的片段和载体相连 C. 其他工具酶 修饰, 加工等作用 限制性内切酶II及其产生的3种不同末端 5突出的粘性末端 3突出的粘性末端 平末端 EcoR I EcoR V Pst I P P P P P P 同切酶和同粘酶 同切酶: 识别相同的位点, 但生成不同的末端. 同粘酶: 识别不同的位点, 但产生相同的粘性末端 Sma I 5′ ... C C C^G G G ... 3′ 3′ ... G G G^C C C ... 5′ Xma I 5′ ... C ^ C CG G G ... 3′ 3′ ... G G GC C ^ C ... 5′ 同切酶 BamH I 5′ ... G^G A T C C ... 3′ 3′ ... C C T A G^G ... 5′ Bgl II 5′ ... A^G A T C T ... 3′ 3′ ... T C T A G^A ... 5′ 同粘酶 Sau3A 5′ ... ^G A T C ... 3′ 3′ ... C T A G^ ... 5′ 连接酶及其对底物的要求: T4 Ligase, Ecoli Ligase 底物: 自由5’末端和自由3’末端, 5’末端带磷酸基团 反应条件：Mg++，ATP存在 聚合酶(polymerase): DNA聚合酶I, klenow片段, Taq, Pfu, 末端转移酶 外切核酸酶(exonuclease): exo III, S1核酸酶, DNase I 脱磷酸酶(dephosphatase): 碱性磷酸酯酶CIP 磷酸化酶,激酶(kinase) 逆转录酶(reverse transcriptase) RNase H, RNase A 甲基化酶(methylase) 其它工具酶 载体及其构成基本要素 能独立复制并稳定传代:复制起始点ori或自主复制序列ARS和着丝粒, 端粒 方便插入外源片段: 单酶切位点 选择标记: 药物抗性 报告基因: 插入筛选标记 易分离提取 高产率（多拷贝） 强启动子 多宿主 常用载体 质粒(plasmid)，粘粒(cosmid)，噬菌体，噬粒(phagemid), 病毒，PAC，YAC，BAC 特殊用途的载体 表达型载体， 分泌型载体，穿梭载体 宿主 繁殖快, 易于培养, 能够快速得到产物 对所携带基因的表达产物具有较高耐受性, 具有克隆最多种基因的可能 突变率低, 能够稳定忠实的保存被克隆基因 常用宿主 大肠杆菌: 繁殖快, 易培养, 易分离产物 噬菌体: 转化效率高, 易于保存 酵母: 繁殖最快的真核生物, 适于有蛋白质加工的基因表达 lacZ 如何提高克隆效率? 提高插入片段和载体的比例 尽可能采用粘端连接* 载体脱磷以降低载体自连 插入片段磷酸化 改进转化条件 问题: 有一外源片段用某种酶切,生成了5′ 突出粘性末端　 5′ -GATC, 但是载体上的单酶切位点只能生成下面这几种粘性末端: 5′-CTAG 5′-TCGA 5′-TTAA 应当采用怎样的策略来提高连接效率? 不依赖于内切酶和连接酶的体外重组 位点专一性重组 （依赖于短片段同源序列的重组） cosN, LoxP LoxP LoxP cre LoxP LoxP Transform +report gene substrates 新鲜组织研磨或匀浆 RNA提取液 总RNA 过oligo(dU)柱 洗脱 mRNA AAAAAAAA TTTTTTTTT AAAAAAAA AAAAAAAA rRNA tRNA mRNA 筛选DNA文库 用标记的核酸作为探针 用诱饵质粒筛选表达cDNA文库 探针标记 标记物： 同位素标记：32P 非放射性标记：荧光标记，生物素，dig(地高辛）等 变性 模板DNA 随机6核苷酸引物， dNTP, 某种标记dNTP DNA Pol I 5‘ 随机引物 标记的DNA片段 REMOVE REMOVE Inserted DNA coding Protein for detection GAL4-AD lacZ bait DNA Inserted DNA coding Protein for detection