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1 蛋白灰度分析总结 By sssholy 2012-08-26 （stejun@） 蛋白灰度分析软件有：Image-Pro Plus，Quantity One，Image J 等~~ 但总的来说： （1）Image-Pro Plus 综合性能最好，操作简便结果可靠！因为它有强大的 IOD算法， 能准确反应蛋白灰度~~ 但需要靠魔棒或轨迹法选取目的蛋白区域，有一定的主观性，不过蛋白灰度测定本 身就是半定量分析-----测量值本身就没有一定标准，不同软件测量值不同，即使相同 软件重复测量数值也不一定相同，因此只要测定数值能反应目的蛋白变化趋势，测 量值相对偏差不大即可~~~ （2） Quantity One 有泳道-轨迹测定法，等高线/手绘选取目的区域测定法等方法。 ⅰ.泳道-轨迹测定法： 过程：先剔除一系列背景，再选择泳道（lane），然后分析条带（band）,最后使用高 斯建模得出灰度分析值（Gauss Model trace） 特点：感觉比较科学，重复性好，但十分繁琐，而且有时不能正确反应灰度（我亲 测过，亲~~）。 ⅱ.等高线-手绘选取目的区域测定法：通过等高线或手绘选取目的蛋白区域，最简便， 但重复性不太好。 （3）Image J 最坑爹~~~，它用魔棒选取区域测定灰度，可是有时很难选中所需区域， 而且方法繁琐，不推荐！！ 在此，只总结综合性能最好的 Image-Pro Plus（IPP）蛋白灰度分析方法~~~~ 2 Image-Pro Plus 分析蛋白灰度教程 说明：目的蛋白的灰度=目的蛋白 IOD值/ 相应内参 IOD值 1. 使用 Photoshop 剪切出目的区域（只含 western bolt 条带，如图），保存为 TIFF格式文件。 2. Image-Pro Plus打开文件，剔除背景： （1） 放大镜放大目的区域 （2） Measure---calibration---intensity---options----image, 选择背景最大 value 值------ok-------ok----system----close (3) Measure---count/size---measure---select measurements，选择 IOD为测量值， 调整结果显示方式：Options-label style 改为 mesurement，选择 IOD为显示值。 （4）接下来有 2种方法选择目的蛋白区域（即找出 AOI，area of interest, IPP 核 心元件）：魔棒和手绘轨迹法。 魔棒：首选方法，客观科学，适合于蛋白条带轮廓清楚且各蛋白条带不融合（若条 带弥散，相互融合，则魔棒无法选择单一蛋白条带，这时就要用手绘通过肉眼选择 目的蛋白区域）。 手绘轨迹法：主观性较强，当魔棒无法选择单一条带时才使用。 （5）count/size---edit-----convert AOI to object---得出 IOD值 （6）若测下一条带，则点 NEW AOI按钮，再按以上方法选择 AOI (7) 可以 count/size---view---measurement data显示或输出测量值 图示过程如下： 3 4 5 6 7 魔棒法： Or 手绘轨迹法: 8 得出测量 IOD值： 下图显示的即为目的蛋白 IOD值 9 重复测量其他条带： 10 相关介绍： 1.1光密度与灰度—迷惑人的不同概念 ? 光密度：吸收光的物质的光学密度。（optical density,就是常说的OD值）光密度值是直接与 染色物质的量相关的。 ? 灰度：灰是不够黑，是反射亮度的单位。电子 照片上像素的亮度称为灰度。 Gray: between white and black Example: 1.The bright value on display screen is gray value. 2.The dark value on a white paper is also the gray value. 255 用OD值是正确的 ? 分光光度计与酶标仪的测定值是OD值 ? 透射的显微镜图象上的光强度要用OD值 ? 蛋白电泳条带的测量也是OD值。 ? 萤光显微镜及萤光分光光度计的测量值是萤光强度 (Fluorescence intensity) ?