亲和纯化技术分解.pptVIP

1 第九章 亲和纯化技术 利用生物分子间的特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术（affinity purification technology ） 2 技术要点 （1）找与底物专一可逆结合的配基； （2）将配基通过共价键偶联到基质； （3）配基与底物吸附； （4）洗脱目标物。 3 亲和纯化技术 亲和层析(Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离） 亲和分配（双水相萃取） 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 亲和沉淀（沉淀） 亲和电泳（电泳） 4 第一节 亲和层析(Affinity Chromatography) 利用生物大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性而建立的层析技术。 适用于从成份复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物。 5 特点 经过一次处理可得到高纯度活性物质 ； 特异性强、分离效果好、分离条件温和； 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。 6 亲和吸附剂：载体—配基 在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基（Ligand）。 与配基结合的层析介质称为载体（Matrix）。 7 一、亲和层析的原理 （1）配基固定化：配基与载体偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质。 （2）吸附样品：亲和层析介质选择性吸附生物活性物质. （3）样品解吸：选择适宜的条件使被吸附物活性物质解吸。 动画 8 二、亲和层析载体 （一）、亲和层析对载体的要求： （1）充分功能化，与配基进行共价连接。 （2）有较好的理化稳定性和生物惰性。 （3）具有高度的水不溶性和亲水性。 （4）具有多孔的立体网状结构。 （5）应为大小均匀的刚性小球。 9 （二）、常用载体 纤维素 (cellulose) 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它载体——壳聚糖 (Chitosan) 10 1、纤维素 纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入。 非特异性吸附力较强，空间位阻。 主要用于分离与核酸有关的物质。 11 2、琼脂糖凝胶 琼脂糖浓度有2%、4%、6%，商品为Sepharose 2B、4B和6B（Pharmacia）。 保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。 Sepharose CL,稳定性明显增加，能在pH3~14中应用。 12 3、葡聚糖凝胶： 葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，应用受到限制。 4、聚丙烯酰胺凝胶： Bio-gel P 有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。 pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。 13 5、多孔玻璃珠： 化学与物理稳定性较好，机械强度高。 缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附，化学活性基团少。 6、其它载体——壳聚糖(Chitosan) 14 壳聚糖(甲壳素和壳聚糖) 15 三 、 亲和配基 配基的选择 配基的浓度 配基偶联的位置 配基分子的大小 配基的类型 16 （一）、配基的选择 亲和层析配基的选用主要取决于分离对象。 1、配基与配体有足够大的亲和力 （亲和势），KL 在10-4～10-8之间。 2、配基与配体的结合应是专一的 。 3、配基应具有化学活性 。 17 亲和势—KL（EL复合物的解离常数 ） 分配比: 结合酶/游离酶 阻留值: Ve/V0 18 （二）、配基的浓度 对亲和势比较低的系统（KL≥10-4mol/L），增加配基浓度有利于吸附。 增加亲和柱的长度来提高吸附率。 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。 理想的配基浓度为1-10μmol/L。 19 （三）、配基偶联的位置 配基固定化时，其不参与亲和结合的部位与载体进行偶联。 AMP-Sepharose亲和柱 腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对脱氢酶和甘油激酶有吸附力。 磷酸基接到载体上，对甘油醛-3-磷酸脱氢酶有吸附力。 20 （四）、配基分子的大小 选用大分子配基。 小分子物质作为配基，载体和配基间插入一个“手臂”以消除空间障碍。 21 （五）、配基的类型 较小的有机分子或天然生物活性物质。 根据配基应用和性质:特殊配基和通用配基。 特殊配基（special ligand） 22 通用配基（general ligand） 用于一类物质的分离提纯。 用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配基； 用ATP作激酶类亲和层析的通用配基； 用外源性凝集素作糖蛋白类亲和层析时的通用配基等。 23 第一节 亲和层析 一、亲和层析的原理 二、亲和层析载体 三、 亲和配基 四、载体的活化