實验十一 蛋白质含量的测定.pptVIP

实验十一 蛋白质含量的测定 一、目的要求 1.学习和掌握蛋白质含量测定的原理 2.掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度的操作技术 二、原理 微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。 因为蛋白质含氮量通常在16 %左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。 Folin—酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度 蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。 紫外分光光度法测定蛋白质浓度 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，