4.细胞化学染色课件.pptVIP

第四章 细胞化学染色;细胞化学染色，是一种以形态为基础，结合运用化学或生物化学技术对血细胞内各种化学成分作定位、定性及半定量分析的方法。 用于研究血细胞生理、病理和化学结构； 临床上为某些血液病的诊断、鉴别诊断、疗效观察、预后监测和发病机制的探讨，提供重要依据。;血细胞化学染色的基本要求是在原位显示细胞成分和结构，故在染色时应尽量保持细胞的生前结构、化学成分和酶活性，反应产物应是有色沉淀物，具有一定的稳定性。 血细胞化学染色可显示糖原、脂类、酶、蛋白质，包括某些氨基酸、蛋白质SH基、结合的糖蛋白、粘蛋白、核酸（包括RNA，DNA）、及无机盐等。;血细胞化学染色首先是要固定骨髓片或血片，然后才是各种定性、定量的特殊染色。 （一）固定 固定有物理法与化学法， 前者为干燥和火焰固定， 后者最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。;（二）显示 1、偶氮偶联法：这类方法多利用人工合成的酶底物，在酶作用下，产生分解产物，再与重氮盐结合引起偶氮偶联，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的存在。 2、联苯胺法：粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶作用于过氧化氢，释放新生态氧，使无色的联苯胺形成蓝色沉淀。;3、普鲁士蓝法：细胞内、外铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。 4、雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀。 5、四唑盐法 6、金属沉着法 其他尚有物理学方法，如脂溶性染料染色（显示脂质）、荧光显示、放射自显影以及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学诊断。 ;（三）细胞化学定量 粗略估量，以染色反应的强弱，受色的深浅，人为地区别为阴性和各种程度的阳性。 百分法，只能反映细胞阳性率，不能反映受色强弱。 积分法，是常用的半定量法，将前述的等级估量与百分率相结合（计算方法见碱性磷酸酶染色），它既反映了细胞阳性率的高低，又反映了细胞受色的强弱。 流式细胞仪测定单个细胞内的化学成分含量。 以细胞受色反应的强弱比色，常用于RNA、DNA定量测定和各阶段幼红???胞胞浆中血红蛋自定位、定量等。;1985年国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐了五种方法，即： 过氧化物酶法、碱性磷酸酶法、酸性磷酸酶法、非特异性酯酶法、氯乙酸AS-D蔡酚酯酶法。 这些方法学在白血病的鉴别诊断上很重要，须对其染色方法和临床意义加以充分地理解。下面介绍几种常用的细胞化学染色方法。;一、过氧化物酶染色（POX） ;【试剂】 1. 1%TMB (3,5,3,5气四甲基联苯胺）乙醇溶液O.lg TMB溶于100m1 88%乙醇中，置棕色瓶内，放冰箱中保存。 2. 亚硝基铁氰化钠饱和溶液在少量蒸馏水中加人亚硝基铁氰化钠晶体，至不再溶解为止，置棕色瓶内，放冰箱中保存。 3. 1%过氧化氢溶液取30%过氧化氢l ml加人蒸馏水29m1，放冰箱中。 4. 稀过氧化氢溶液取过氧化氢1滴，加l0 ml蒸馏水稀释（需临时配制）。 5. 瑞氏染色液。; 【操作】 1．取0.1%TMB乙醇溶液lml，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10l，溶液呈淡棕黄色。 此试剂在临用时配制。 2.在新鲜干燥的血片上，加0.1%TMB-亚硝基铁氰化钠饱和溶液的混合试剂0.5m1, 放置lmin后，再加稀过氧化氢溶液0.7m1，吹匀，染色6min 。 3．倾去染液，待干，再用瑞氏染液复染15～20min 。 4.用水洗后，待干，用油镜镜检。; 【结果】 细胞质内有蓝黑色颗粒者为阳性。 （－） 无颗粒沉着； （±） 颗粒细小 ，分布稀疏； （+） 颗粒较粗，局灶分布； （++） 颗粒粗大，分布较密，占胞质 1/2~2/3； （+++） 颗粒粗大，呈团块分布； （++++） 全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核。;【临床意义】 （1）粒系： POX主要分布在粒细胞和单核细胞内，分化差的原始粒细胞阴性，分化好的原始细胞可出现蓝黑色颗粒，自早幼粒细胞至成熟粒细胞均呈阳性反应，随着细胞成熟的程度而逐渐增强，中性分叶核粒细胞为强阳性。 嗜酸性粒细胞阳性程度最强，其阳性颗粒比中性粒细胞粗大，有折光。 碱性粒细胞为阴性。 ;（2）单核细胞： 原始单核细胞为阴性反应， 幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性反应，颗粒细小，弥散分布。 （3）其他细胞： 淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、组织细胞、巨核细胞均呈阴性反应。 （4）血小板过氧化物酶主要定位于幼稚型巨核细胞的核膜上，可作为原巨核细胞的一种标志物，有助于FAB M7的识别。 ;（5）过氧化物酶染色 主要用于鉴别急性白血病类型， 急性髓细胞白血病多呈阳性反应，以M3和M2型反应最强，MI和M5型反应较弱， 故有助于区别M3和M5型。 急性淋巴细胞白血病呈