温州医学院《分析化学》18-高效液相色谱.PPTVIP

1 组：脂肪醚（纯质子接受体） 2 组：脂肪醇（质子接受-给予体） 3 组：吡啶衍生物、四氢呋喃（质子接受体，易极化） 4 组：乙二醇、苄醇、乙酸、甲酰胺（质子给予体） 5 组：二氯甲烷、二氯乙烷（大偶极距） 6 组：脂肪酮、酯、二氧六环、腈 7 组：芳烃、芳醚、硝基化合物 8 组：氟代醇、氯仿、水（质子给予体） 流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。 3. 流动相选择 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 选择流动相时应注意的几个问题 （1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）使用前需要用微孔滤膜过滤，除去固体颗粒。 （3）流动相使用前最好脱气。 18.6 高效液相色谱仪 输液系统 进样系统 色谱柱系统 检测系统 温控系统 记录系统 液相色谱法的一般流程简略图 1. 柱塞往复泵 无脉动 流量恒定 能自由调节流量 耐高压 耐腐蚀等特性 18.6.1 输液泵 2. 梯度洗脱装置 高压二元梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 低压梯度: 在常压下, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。 18.6.2 进样器与色谱柱 1. 进样器 流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置 2. 色谱柱 柱体为直型不锈钢管，内径2～4.6 mm，柱长10～25 cm。 3. 色谱柱柱效的评价 药典规定，用HPLC建立分析方法时，需进行“系统适用性试验” 最小理论塔板数、分离度、重复性和拖尾因子 * 仁济学院 第十八章 高效液相色谱法 High Performance liquid Chromatography (HPLC) 18.1 概述 高效液相色谱法（HPLC）：在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱法的理论和实验方法，采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，发展而成的一种现代液相色谱分析方法。 一、HPLC与GC差别 二、特点 一、HPLC与GC差别 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别 1．分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚 物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制, 分子量大、 难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均 可检测用途广泛 占有机物的80% GC：流动相为惰性气体 流动相与组分无亲合作用力，仅起运载作用；组分只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性 2．流动相差别 二、HPLC的特点 ①适用范围广（可分析80%有机化合物，广泛应用于各种药物及其制剂的分析测定） ②分离性能好 ③分析速度快 ④流动相可选择性范围宽 ⑤灵敏度高 ⑥色谱柱可反复使用（与经典色谱相比） ⑦流出组分容易收集 ⑧安全 18.2 HPLC的分类和基本原理 18.2.1 HPLC的分类 1．按固定相的聚集状态分： 液-液色谱法（LLC）和液-固色谱法（LSC） 2．按分离机制分： 分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱 分子排阻色谱 化学键合相色谱 亲合色谱 手性色谱 18.2.1 基本原理 塔板理论 速率理论 在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/u较小，可以忽略不计，即：