细菌学教学课件 第十五章 细菌的细胞工厂.pptVIP

（3）菌丝速冻法 不产孢子或芽胞的微生物。-20℃保藏。 （4）石蜡油封存法 向斜面上倒灭菌等石蜡油。保存期一年。保藏温度-4～4℃。 原理：液体石蜡使菌处于生长和代谢停止状态，还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。 （5）真空冷冻干燥法 适用各种微生物，存活时间长、效果好保存期5年以上。需加入冻干保护剂。 优点：还具有体积小、不易污染、便于运输等优点，是一种用得最为广泛的菌种保藏方法。 （6）液氮超低温保藏法 保存温度-196 ℃，长期保存。需加入冻干保护剂。 几种常用菌种保藏方法的比较 方法名称 主要措施 适宜菌种 保藏期 评价 冰箱保藏法（斜面） 冰箱保藏法（半固体） 石蜡油封藏法* 沙土保藏法 冷冻干燥法 低温 低温 低温、缺氧 干燥、无营养 干燥、无氧、低温、有保护剂 各大类 细菌、酵母菌 各大类** 产孢子微生物 各大类 3~6月 6~12月 1~2年 1~10年 5~15年以上 简便 简便 简便 简便有效 简便有效 973项目 细胞工厂构建示意图 以Corynebacterium glutamicum ATCC13032为出发菌株，构建了在好氧条件下高效生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌突变株。通过失活琥珀酸脱氢酶复合体，失活乳酸和已知乙酸的生成途径，过表达回补途径，引入枯草芽孢杆菌的乙酸回收利用途径，过表达柠檬酸合酶，最优菌株能够积累241 mM琥珀酸，生产率为3.55 mM h-1，得率为0.63 mol (mol glucose)-1 目前细胞工厂构建的主要进展 1、芬兰Delft 大学从木糖限制性的工程菌种筛选到一株可以有效利用木糖和葡萄糖混合物，从这种混合培养基中获得了0. 49g/g 乙醇产量。 2、Wisselink 等人构建出一株菌可以充分利用培养液中的养分，可以减少40%的发酵时间。 3、在运动发酵单胞菌中表达木糖异构酶、木酮糖激酶、转酮酶，乙醇产出量增加 44.7%。 在运动发酵单胞菌中截去SacB(果聚糖蔗糖酶)基因的一部分，乙醇产量增加19%，蔗糖利用率从80%增加到95%。 谢 谢！ * 体外同源重组技术 诱变筛选的典型流程 出发菌株（沙土管或冷冻管） 或摇瓶培养24h 斜面 单孢子悬液 细菌悬液 诱变处理 稀释涂平板 调取单菌落传种斜面 摇瓶初筛 挑出高产斜面 留种保藏菌种 传种斜面 摇瓶复筛 挑出高产菌株作稳定性试验和菌种特性考察 放大罐试验，中试考查 大型投产 原种特性考查 处理前后活菌计数并统计存活率 观察菌落形态，统计形态变异率 对照组比较 对照组比较 2.3.2.3 诱变育种中应注意的问题 选择好出发菌株 复合诱变因素的使用 剂量选择 变异菌种的筛选 高产菌株的获得需要筛选条件的配合 几种诱变剂的使用方法 （1）紫外线：诱变的最有效波长是260nm左右（253~265），处理菌的悬浮液，功率15W，距离30cm左右。 诱变机制：形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性，造成菌体变异甚至死亡 （2）快中子：中子分为快中子和慢中子。慢中子的能量为0.025~100e；快中子的能量为0.2~10百万e。 诱变机制：中子不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核射出质子来，因而快中子的生物学效应完全是由质子造成的。 （3）航天育种 即利用空间环境高真空、微重力和强辐射的特点，在宇宙射线辐射的作用下，使生物的遗传性状发生变异，从而选育出优良菌种。 航天育种的特点是：变异频率高、变异幅度大，有益变异多，稳定性强，因而可以培育出高产、优质、早熟、抗病良种。 抗噬菌体菌种的选育 噬菌体的分布 广泛分布于自然界，土壤、肥料等。 有寄主就有它们的噬菌体。 抗噬菌体菌株的选育 原因：噬菌体变异，产生新的噬菌体，原抗性菌种出现不抗，所以需不断选育新的抗性菌株，确保生产。 抗噬菌体选育的几种方法 自然突变：以噬菌体为筛子，敏感菌株的孢子不经任何诱变由其自然突变为抗性菌株。获得的抗性突变率很低。 诱发突变：敏感菌株先经诱变因素处理，然后将处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培养基上，经诱变后的存活孢子中，如存在抗性变异菌株就能在此平板上生长。 抗噬菌体菌株的特性试验 抗噬菌体性状的稳定性试验：孢子培养，种子培养，发酵培养，多次传代。 抗性菌株的产量试验：生产能力不低于原敏感菌株，考察对其他培养条件的要求。 真正抗性与溶原性的区别：溶原性菌株因细胞中存在原噬菌体，对同一类型噬菌体具有免疫性。噬菌体可能被释放。 杂交育种 杂交育种：是指两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。 常规的杂交育种:不须用脱壁酶处理，就能使细胞结合而发生遗传物质重新组合。 杂交育种的目的 使不同菌株的遗传物质进行交换和重组，从而改变原