流动注射-共振光散射联用技术测定注射液中肝素的含量.pdfVIP

流动注射-共振光散射联用技术测定注射液中肝素的含量 代小霞 李原芳 黄承志＊ （西南大学化学化工学院，重庆 400715） 摘 要 在近中性介质中，亚甲基兰与肝素作用产生共振光散射（ RLS）增强信号，最大散射峰位于 365. 0 nm 处，增强的共振光散射强度（DIRLS）与肝素浓度具有线性关系，据此建立了流动注射-共振光散射联用技术测 定痕量肝素的新方法。在 pH 为 7. 96，离子强度为 0. 0275 mOI / L 的载流中加入肝素后，在 365. 0 nm 处产生增 强的 RLS 信号。采用时间扫描测定该增强 RLS 强度，在最佳实验条件下，可检测 1 ~ 20 mg / L 肝素，检出限为 8. 41 mg / L。对浓度为 4. 0 mg / L 的肝素钠标准液平行测定 11 次的相对标准偏差为 3. 2% 。用于注射液中肝 素含量的测定，RSD 小于 2. 3% 。 关键词 流动注射，共振光散射，肝素，亚甲基兰 2004-12-06 收稿；2005-03-15 接受 本文系国家自然科学基金（NO.20425517）和重庆市自然科学基金资助项目 ! 引 言 肝素（Heparin，Hep）是一种带负电的葡糖胺聚糖，是多糖的一种［1］，其复杂的结构导致其具有复杂 的生物学功能。自 1937 年临床应用以来，肝素一直是一种主要的抗凝药物，除了抗凝活性及其相关的 抗血栓生成活性外，还具有抑制平滑肌细胞增殖、抗炎症、抗肿瘤及抗病毒等生物学功能，并且这些生 物活性同抗凝活性无关，而同肝素的特异结构密切相关［2］。对不同的疾病，肝素有不同的最适剂量， 临床上需要进行监控。因此，研究肝素定量测定的方法非常重要。 肝素的检测方法主要分为生物方法和化学方法两大类。临床上常采用生物方法进行监控，但受个 体影响较大，使其应用受到限制。化学方法主要有分光光度法［3 ~ 5］、共振瑞利散射法［6，7］、高效液相色 谱（HPLC）法［8］、毛细管电泳法［9］、电化学传感器［10］等。目前肝素的检测方法还远不能满足对肝素结 构和功能认识的迫切需要。 亚甲基兰（methyIene bIue，MB）为吩噻嗪类染料，其可以与肝素以静电引力结合形成复合物，并导 致共振光散射强度显著增强，且增加的共振光散射的信号强度与肝素浓度成正比。据此建立了流动注 射与共振光散射（FIA-RLS）联用测定肝素新方法，本方法结合了流动注射和共振光散射技术，具有简 便、快速、线性范围宽、灵敏度高的特点。 # 实验部分 #. ! 仪器和试剂 F-2500 荧光分光光度计（日本日立公司），配有一个 90 ! L 的流通池。ND 型交流可逆电动蠕动泵 （30 r / min，上海仪表电机厂），可加样 100 ! L 的八通阀（温州市龙方仪器配件厂）；内径为 0. 8 mm 的聚 四氟乙烯反应盘管。PHS-10A 数字酸度计（浙江省萧山科学仪表厂）；MVS-1 漩涡混合器（北京北德科 学仪表厂）。 100 mg / L 肝素钠和 2. 0 X 10 - 3 mOI / L 亚甲基兰储备液分别由肝素钠固体（中国医药集团上海化学 试剂公司，160 IU / mg）和亚甲基兰（上海第三化学试剂厂，上海）溶于水配成，使用时逐级稀释到所需浓 度。使用 BrittOn-RObinsOn（BR）缓冲溶液（pH = 7. 96）：0. 04 mOI / L 的混合酸（磷酸、冰醋酸、硼酸）溶液 和 0. 2 mOI / L NaOH 溶液按一定比例配成，1. 0 mOI / L NaCI 溶液调节反应体系的离子强度。除肝素为生 化试剂外，其余试剂均为分析纯。实验均用二次去离子水。 第 33 卷 2005 年 11 月 分析化学（FENXI HUAXUE） 研究报告 Chinese JOurnaI Of AnaIyticaI Chemistry 第 11 期 1535 ~ 1538 2. 2 实验方法 载流溶液由染料 MB 和缓冲溶液组成。每次注样前，先用载流冲洗流路至基线平稳，然后按图 1 注入肝素钠溶液。采用荧光光度计的时间扫描形式，在激发和发射波长为 365. 0 nm，通带宽度为 5. 0 nm，光电倍增管的电压为 400 V，测定光散射强度。 3 结果与讨论 3. 1 流路中物理参数的影响 在 MB 浓度为 2. 0 10 - 4 mol / L，肝素为 4. 0 mg / L 时，实验了包括载流的种类、注样体积、反应管长 度和流速等物理参数对体系共振光散射强度的影响。二次水、BR 缓冲溶液、MB 以及 MB 和 BR 缓冲溶 图 1 流动注射-共振光散射测定肝素装置 Fig. 1 Flow injection