靶向线粒体转录因子A大鼠活体RNA干扰实验和建立动物模型的论文.docVIP

　　靶向线粒体转录因子A大鼠活体RNA干扰实验和建立动物模型的论文 【摘要】 目的：在体外构建并筛选出靶向线粒体转录因子a（tfam）的有效rna干扰慢病毒载体，用于大鼠整体rnai实验，观察其对肝组织中目的基因表达的干扰效果。方法：设计4条sirna序列并合成双链dnaoligo，制备目的基因rna干扰慢病毒载体，体外感染目的细胞，利用rt-pcr和的表达情况，从而筛选出有效的干扰靶点。构建大鼠活体rnai动物模型，观察大鼠肝脏中靶基因表达的变化情况。结果：酶切鉴定及测序结果均提示sirna序列成功连接入载体中。rt-pcr结果提示3号靶点的干扰效率最高，达到了55％左右，靶向rna干扰慢病毒载体构建成功，能有效抑制目的细胞中线粒体转录因子a的表达。构建的慢病毒载体在大鼠活体内也具有良好的干扰效果。该研究为下一步利用此慢病毒载体进行活体rna干扰打下了基础。　　【关键词】 靶向线粒体转录因子a·rna干扰·慢病毒载体·模型，动物·大鼠，ent of experimental aminal model of rnai in vivo using lentivirus-sirna vector system targeting tfam 　　lin heng, tang chun, ilitary medical university （chongqing 400038, china） 　　【abstract】 objective: to construct a rebinant lentivirus vector of rna interference targeting mitochondrial transcription factor a （tfam） gene and to select the most efficient small interfering rna （sirna） to suppress tfam in target cells, and to use the selected lentivirus vector in vivo and to analyze its efficacy. methods: according to genbank information of tfam, four sirna and double strand dna ed by pcr and sequencing, then it expression ined by pcr and ost efficient lentivirus vector expression in liver e digestion and sequencing shoed its efficacy. the result of rnai in vivo also proved its efficiency. conclusion: the rebinant lentivirus vector of rna interference targeting tfam has been successfully constructed. it can effectively suppress tfam expression in vitro and in vivo. 　　【key itochondrial transcription factor a·rna interference·lentiviral vector·rats,itochondrial transcription factor a，mttfa，tfam）的sirna，并利用慢病毒载体系统将体外实验筛选出的有效sirna通过门静脉传输至大鼠肝脏，观察其体内的干扰活性，从而构建出大鼠活体rna干扰实验动物模型，为下一步实验研究打下坚实的基础。 　　1　材料与方法 　　1.1　动物来源及分组　 　　健康-mlv逆转录酶、dntp、rna酶抑制剂均购自美国promega公司；pcr用试剂、引物购自上海吉凯基因技术有限公司；胰酶购自上海化学试剂公司；胎牛血清、dmem、rpmi1640及opti－mem均购自美国gibco公司；脂质体lipofect2000、总rna提取试剂trizol均购自美国invitrogen公司；山羊抗tfam、小鼠抗gapdh、抗山羊igg、抗小鼠igg均购自美国santacruz公司；bca protein assay kit购自美国hyclone-pierce公司；ecl-plus/kit购自美国amersham公司。 　　1.3　方法 　　1.3.1　构建慢病毒载体　 　　针对目的基因tfam的基因序列，利用公用网站按照rna干扰序列的设计原