食管鳞癌中p16基因启动子区甲基化的论文.docVIP

　　食管鳞癌中p16基因启动子区甲基化的论文 【摘要】 目的 探讨食管鳞癌（escc）p16基因甲基化的状况及其表达与食管鳞癌临床病理特征之间的关系。方法 采用甲基化特异性 pcr方法（msp）分别检测75例食管癌组织、癌旁组织和切缘组织p16基因启动子区域cpg岛甲基化状态。采用envision免疫组化法检测食管癌组织及癌旁组织的p16蛋白的表达。结果 75例标本中，食管癌组织、癌旁组织和切缘组织p16基因甲基化率分别为41.3 %（31/75）、13.3%（10/75）和6.67%（5/75）。癌组织和癌旁组织p16蛋白的阳性表达率分别为29.3%（22/75）和56.7%(17/30)。31例癌组织p16基因甲基化阳性标本中有2例(6.4% )检测到p16蛋白的表达，而44例癌组织p16基因甲基化阴性标本中有20例(45.5% )检测到p16蛋白的表达。食管癌组织p16基因甲基化率显著高于癌旁组织和切缘组织(plt;0.01)，p16蛋白表达与p16基因甲基化呈负相关。p16基因启动子区甲基化与食管癌的组织学分级、肿瘤部位无明显相关，与临床分期、淋巴转移密切相关。结论 p16基因甲基化在食管癌发生发展中起着重要作用，食管鳞癌的分期和淋巴结转移与p16基因甲基化之间有密切关系。 【关键词】 食管鳞 p16基因 dna甲基化 甲基化特异性pcr 食管癌中抑癌基因缺失、突变和蛋白表达等的遗传学机制研究报道比较多见。.然而近来大量研究表明dna甲基化是肿瘤抑制基因失活的重要表观遗传学机制。各种类型肿瘤具有特征性的甲基化模式，不同病人的肿瘤其甲基化模式也可不一样。p16基因是第一个被证明为参与细胞周期调控机制内在成分的抑癌基因，其编码生成的16kd的p16蛋白是细胞增殖的负调节物[1]。为探讨p16基因甲基化在食管癌发生中的作用，我们运用msp方法和envision免疫组化法对食管癌的p16基因甲基化状态及其蛋白表达进行了检测和分析。 1 资料和方法 1.1 一般资料 组织标本来源于食管癌高发地区揭阳及汕头市的2006年5～9月手术切除的食管癌手术新鲜组织标本，包括食管癌组织、癌旁组织和手术切缘黏膜组织各75例。获取新鲜标本后一半迅速冻存于液氮然后转存于-70℃冰箱中，另一半用10％福尔马林固定后送作病理诊断，癌组织石蜡包埋连续切片用于免疫组织化学染色待用。本组75例中男58例，女17例，年龄46～70岁，中位年龄59.2岁。术前均未经放疗和化疗，手术切除后病理证实为鳞状细胞癌，取癌旁黏膜组织以超过癌肿边缘3cm为正常组织。高、中、低分化者分别为19例、31例、25例。tnm分期为ⅱ期22例、ⅲ期34例、iv期19例。分别选取75例食管鳞癌组织及其癌旁组织、手术切缘进行甲基化检测。选取所有癌组织和30例癌旁组织进行p16蛋白免疫组化检测。 1.2 主要试剂与仪器 组织基因组dna提取试剂为北京天为时代科技有限公司产品；甲基化修饰试剂为chemicon公司产品，taq dna热启动聚合酶为qiagen公司产品；pcr 引物由上海生工生物技术有限公司合成。pcr扩增仪为德国personal cycler；凝胶成像系统为美国uvp 8000。鼠抗人多克隆抗体p16为chemicon公司产品，envision试剂盒为dako公司产品。 1.3 方法 1.3.1 组织dna的提取 采用吸附过柱的方法提取组织dna。新鲜组织样品取25mg用液氮碾碎。用蛋白酶k于56℃消化过夜，其余步骤按试剂说明书操作。用核酸蛋白分析仪检测dna的含量和纯度。 1.3.2 dna的亚硫酸氢盐修饰 采用dna cpg岛甲基化修饰试剂盒（cpgenome dna modification kit，chemicon公司，s7820）对dna样品进行亚硫酸氢钠修饰。具体操作按试剂盒说明书进行。取1.0μg dna样品溶于100μl h2o中，加入7.0μl 3m naoh，50℃温育10min。加入550μl新鲜配制的dna修饰试剂ⅰ，振摇后于50℃避光温育4～16h。然后进行脱盐、去磺基、二次脱盐，最后用25μl的te把dna洗脱下来。 1.3.3 pcr扩增 按照文献[2]设计两对引物，见表1。分别为p16的特异性甲基化引物（p16-m）和p16的特异性非甲基化引物（p16-u）对修饰后的dna样品作pcr扩增。每个pcr反应体积为25μl，内含：1.5mmol/l的mgcl2；200μmol/l的dntps，200nmol/l的引物，经亚硫酸氢盐修饰的dna样品1μl。pcr反应条件：95℃ 15min，95℃ 40s，62℃ 40s， 72℃ 40s，共40个循环，最后72℃ 10min。以p16基因甲基化的人结肠癌细胞系rko提取的d