变性高效液相色谱法筛选XRCC4基因突变.docVIP

　　变性高效液相色谱法筛选XRCC4基因突变 作者：贾静 潘建基 苏颖, 陈增, 邹长棪 陈传本 潘才柱 【摘要】 　　目的 应用变性高效液相色谱技术(DHPLC)异源双链分析对鼻咽癌患者XRCC4基因突变进行筛查与鉴定，研究鼻咽癌患者XRCC4的基因突变情况，探讨DHPLC在筛查相关基因突变、预测放疗敏感性方面的应用。 方法 采用聚合酶链反应(PCR)和DHPLC筛查88例鼻咽癌患者XRCC4基因的突变。 结果 对DHPLC图形异常的PCR扩增片断进行DNA测序鉴定突变位点及性质，检测出28例XRCC4基因8号外显子第377位C变成T，导致126号密码子的ser→phe，导致氨基酸残基的替代变化(丝氨酸→苯丙氨酸)。 结论 用PCRDHPLC筛查结合测序分析检测XRCC4突变是一种高效、 经济 、简便、可靠的方法。 【关键词】 鼻咽肿瘤 辐射耐受性 突变 肿瘤细胞 培养的 DNA修复 色谱法 高压液相 基因型 　　DNA分子是恶性肿瘤放疗辐射作用的靶点，细胞对电离辐射反应的分子基础是DNA损伤[1]。DNA双链断裂是放射 治疗 过程中的主要损伤形式，而细胞内产生的DSBs可以通过同源重组和非同源末端连接两种途径进行修复。未修复的DSBs损伤将导致细胞死亡。近年来的研究表明，DNA修复基因突变、单核苷酸多态性均可改变DNA的修复能力。因此检测DNA修复基因的分子状态可能成为个体肿瘤放疗敏感性的预测指标。XRCC4是DNA损伤修复的主要基因之一，缺乏XRCC4的细胞特别容易受到离子辐射的伤害。XRCC4基因的突变可能影响肿瘤细胞的DNA损伤修复能力，进而影响其对辐射的敏感性以及放射治疗的疗效。因此，XRCC4基因的突变检测可为其与肿瘤放射敏感性关系的研究以及探讨作为肿瘤个体放疗敏感性的预测指标的可行性提供研究基础。 　　变性高效液相色谱(denaturing highperformance liquid chromatography，DHPLC)是一种高通量筛选基因组DNA序列变异的新手段。本研究采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和DHPLC异源双链分析与DNA测序等方法对88例鼻咽癌患者进行XRCC4基因突变筛查与鉴定，探讨DHPLC检测该基因突变的适宜条件，为DHPLC技术在筛查相关基因突变，预测放疗敏感性的应用方面提供研究基础。 　　 1 对象和方法 　　1.1 对象 收集2002年9月-2003年9月福建省肿瘤 医院 放疗科经病理确诊、初治的鼻咽癌患者88例，男性67例，年龄(48±12.71)岁(21～76岁);女性21例，年龄(48±11.15)岁(26～69岁)。治疗前经鼻咽镜取鼻咽活检组织。DNA抽提试剂盒(德国Qiagen公司);Taq DNA聚合酶(金牌酶，瑞士Roche公司);基因扩增仪(PTC200，美国BIORAD DNA ENGINE公司);DHPLC(4500g2+，DNA模板100 ng，Taq DNA聚合酶1.25 U，上下游引物各0.2 μmol/L。PCR反应条件：94 ℃变性10 min→94 ℃ 40 s→54 ℃～64 ℃ 45 s→ 72 ℃ 35 s，循环35次，72 ℃延伸10 min，PCR产物用1%琼脂糖(含溴化乙锭0.5 μg/mL)凝胶电泳检测。 　　1.2.4 DHPLC筛选XRCC4突变 对有效扩增的PCR 产物行DHPLC筛查突变，检测PCR反应产物，其分离柱固相为烷基化C18，中间桥分子为TEAA，洗脱缓冲液主要成分为乙腈。标本上机之前通过软件分析序列的理论温度分离曲线，摸索出最佳的分离温度后进行突变筛选分析。 　　1.2.5 DNA测序 根据DHPLC系统检测结果，将不同峰型的PCR产物送日本TAKARA公司进行DNA序列测定。 　　 2 结 果 　　2.1 DHPLC筛查结果 每份样本均检测上述5个片段的PCR产物，每份样品在50 ℃的非变性温度下均为对称性单峰;在部分变性的温度下，1号、4号、7号和8号外显子的81片断均为单个色谱峰，只有8号外显子的82片断的扩增产物出现杂合峰与纯合峰两种情况，单个色谱峰显示为纯合链，双峰或三峰表示是杂合异源双链。出现杂合峰显示有突变的异源双链存在。不同样品的PCR产物的8号外显子82段在同一DHPLC运行条件下突变峰形基本相同(代表峰形见图1)，提示8号外显子的82段具有单一类型的突变。 　　2.2 DNA测序结果 选择DHPLC检测为杂合峰与单个峰的标本测序，测序结果显示28例患者的XRCC4基因第8号外显子第377位碱基C变成T(图2)。 　　 3 讨 论 　　DHPLC异源双链分析法是近年来才 发展 起来的一项新的基因突变高通量