补肾康膝方对家兔软骨细胞增殖与凋亡的影响.docVIP

　　补肾康膝方对家兔软骨细胞增殖与凋亡的影响 【摘要】 　　目的观察补肾康膝方含药血清对体外培养的兔关节软骨细胞的增殖凋亡和端粒酶活性的影响。方法取兔的关节软骨，将软骨细胞分离传代后,分为补肾康膝方含药血清组和对照组，置入37℃，50 ml/L的CO2培养箱内培养7 d 后,采用MTT 法检测细胞增殖; TUNEL 法检测各组软骨细胞的凋亡；软骨细胞经扩增后用ELISA 检测端粒酶活性。结果补肾康膝方高、中、低剂量组细胞增殖均高于对照组(Plt;0.05)；补肾康膝方含药血清各组的软骨细胞凋亡率明显低于对照组(Plt;0.05)；补肾康膝方含药血清各组的软骨细胞端粒酶活性明显高于对照组。结论 补肾康膝方可能通过上调软骨细胞端粒酶活性,从而抑制软骨细胞的凋亡。 【关键词】 补肾方；软骨细胞；细胞凋亡；端粒酶 　　Abstract:ObjectiveTo observe the effects of kidney-supplementing , knee-invigorating (KSKI) Prescription containing serum on proliferation and apoptosis of rabbit chondrocytes in vitro . MethodsThe chondrocytes the cartilage of the rabbits , and groups and control group. After the chondrocytes l/L CO2 incubator , thEir proliferation , apoptosis and the telomerase activity groups erase activities erase activity. 　　Key enting； Knee-invigorating prescription； Chondrocytes； Apoptosis； Telomerase 　　骨关节炎主要的病理特征是软骨骨质的降解和软骨中细胞数目明显减少，软骨基质的合成和分解代谢失调，最终关节软骨被破坏。研究表明，软骨中唯一的细胞是软骨细胞，软骨基质主要是由软骨细胞合成和分泌的；软骨细胞的分裂增殖及凋亡的异常在骨关节炎的发病中起到十分重要的作用。补肾康膝方是 治疗 骨关节炎的经验方，对早期骨关节炎疗效显著，本研究主要从补肾康膝方对软骨细胞增殖和凋亡的影响探讨其防治骨关节炎的作用机制，为进一步研发和临床运用打下基础。 　　1 材料与仪器 　　1.1 动物　 　　新西兰兔1 个月龄大，体质量2. 5kg ，雌雄各5 只，由贵阳医学院动物实验中心提供。 　　1.2 试剂　 　　胎牛血清(美国Sigma ,使用前灭活) 、Ⅱ型胶原酶(美国Sigma) 、1.0 g/ L 胰蛋白酶、0.2 g/ L EDTA、DMEM 培养液( Gibco公司) 、二甲基亚砜、MTT(美国Sigma公司) 、端粒酶PCR2EL ISA 检测试剂盒(德国Boehringer Manheiman) 、TUNEL 成套试剂盒(湖北省武汉博士德生物工程公司产品) 。 　　1.3 仪器设备　 　　Olympus 倒置显微镜、培养箱(Heraeus B25060 EK2CO2 ) 、超净台(上海净化设备厂CSB21) 、冷冻高速离心机(Heraeeus) 、酶标分析仪(KⅡ) 。 　　2 方法 　　2.1 兔血清制备　 　　新西兰兔4只，雌雄各半。补肾康膝方(由淫羊藿、黄芪、牛膝、石斛、远志、骨碎补、补骨脂等组成) 按体表面积折算动物的等效剂量，再按10 ml/d 灌胃，正常兔血清以9.0 g/L氯化钠注射液按10 ml/d 灌胃。连续灌胃2 次，中间间隔2 h，分别在末次灌胃后3 h采血。在乙醚和氯胺酮复合麻醉下兔腹主动脉采血，4℃冰箱过夜后，离心(2500 r/min)25 min ，取上清液，抽滤除菌后分装，- 20℃保存备用。 　　2.2 兔软骨细胞的分离与培养将6只新西兰兔空气栓塞处死后, 无菌条件下截取双侧胫骨近端、股骨远端关节软骨，置于D-Hanks 液中冲洗。0.5 g/ L 透明质酸酶溶液室温下消化3 min ，将软骨切成约1 mm3大小，分别以2.0 g/L胰蛋白酶、2.0 g/L胶原酶溶液于37℃，50 ml/L CO2培养箱中孵 育60 min ，1 500 r/ min 离心3 min，弃上清液，网筛过滤后,加入100 ml/L 小牛血清，反复吹打后将软骨细胞接种在25 cm2的培养瓶中，置37 ℃，50 ml/ L CO2 培养箱中。原代细胞长满后传代培养。 　　2.3 含药血清的加入传代细胞接种在24