冰冻血小板对系统血液免疫功能影响的实验研究.docVIP

　　冰冻血小板对系统血液免疫功能影响的实验研究 作者：胡慧红 钱宝华 郭峰 花美仙 查占山 徐建林 【摘要】 目的：探讨不同冰冻血小板复温后对血液系统免疫功能的影响。方法：按不同的实验条件将血液反应系统分为 4 组，自体血小板组（ 自然 体系对照组）、新鲜异体血小板组（自然体系实验组 1）、新型血小板冷冻保护剂组（自然体系实验组 2）、6% DMSO 组（自然体系实验组 3），以灭活 S180 作为激活抗原，采用免疫荧光标记流式细胞仪分析方法，检测血细胞表面相关免疫分子表达影响的变化 规律 。结果：血小板 CD55 和白细胞 CD25 表达水平，自然体系实验组 1较自然体系对照组呈明显上调（P lt; 0.05），自然体系实验组 2 及组 3 均较自然体系对照组上调。血小板 CD59 表达水平，自然体系实验组 1 较自然体系对照组呈明显上调（P lt; 0.05），自然体系实验组 2 及组 3 较自然体系对照组下调。红细胞 CD59 表达水平，自然体系实验组 3 较自然体系对照组呈明显下调（P lt; 0.05）。结论：冰冻血小板对红细胞免疫反应性的抑制作用强于新鲜异体血小板，对血小板、白细胞免疫反应性的激活作用弱于新鲜异体血小板。 【关键词】 冷冻保存；血小板；CD55；CD41；CD59；CD25 〔Abstract〕 Objective To investigate hoic hematogenic immunological function by means of contemporary systemic immunology theory and methodology. Methods Hematological immune systems a cell S180 oleculars on the surface of blood cells eans of immunofluorescence labeling floetry. Results The expression of platelet CD55 and mune response of red blood cell is stronger than fresh allogenous platelets. The activation of cryopreserved platelets to immune response of platelets and a，美国），腺苷（Amresco，美国），FITC 标记抗人 CD55、PE 标记抗人 CD59、CD25、PE/Cy5 标记抗人 CD41（BD，美国），新型冷冻保护剂的配制：阿米洛利 0.0033 g、硝普纳 0.0007 g、腺苷 0.0013 g，溶解于 1 mL DMSO 中，在作为血小板冻存保护剂时，以 1:50 比例加入血小板，使得 DMSO 终浓度为 2%[5]。 1.2 实验设计 1.2.1 冰冻血小板的制备及分组设计 采集 10 位健康合格献血员全血 10 mL（ACD-B 抗凝），2 000 r/min 离心 5 min 获得富含血小板血浆（PRP），后将每份 PRP 按不同的冷冻保护剂等分为 2 组（n = 10），分别应用 6% DMSO（组 1）、新型血小板冷冻保护剂（组 2）作为冷冻保护剂分装至冷冻保护管中放入 - 80℃ 低温冰箱冷冻保存 1 周。 1.2.2 灭活癌细胞（S180）悬液的配制 S180 冰冻试剂（5×106 细胞/mL）37℃水浴箱中解冻，2 500 r/min 离心 5 min，用生理盐水调节 S180 浓度为 4×106 细胞/mL 悬液待用。 1.2.3 新鲜血小板及全血细胞悬液的制备 1.2.3.1 冷冻血小板的复苏方法 从低温冰箱中快速取出上周冻存的冰冻血小板，直接放入 37℃恒温水浴箱中复温，使其在 1 min 内融化，备用。 1.2.3.2 富含血小板的血浆（PRP）及贫血小板血浆（PPP）的分离制备 新鲜采集与冰冻血小板同血型的健康成人 ACD 抗凝全血 10 mL×2，2 000 r/min 离心 5 min，吸取上层 PRP 至硅化管中备用。再从 PRP 试管中取出 500 L，3 000 r/min 离心 10 min，吸取上层 PPP 至另一试管中备用。 1.2.3.3 全血细胞悬液的分离制备 将上述全血细胞用 0.9% 生理盐水（NS）恢复原体积，混匀即为全血细胞悬液。 1.2.4 系统免疫学自然实验体系的设计[6] 试管1：0.2 mL S180+0.3 mL 全血细胞悬液+0.2 mL 自体富含血小板血浆（自然体系对照组）；试管 2：0.2 mL S180+0.3 mL 全血