基因工程讲.pptVIP

（二）反转录病毒载体 反转录病毒(retroviruses)是一类含单链RNA的动物病毒。它的基因组含有2条相同的正链RNA分子，包装成二倍体病毒颗粒。除此之外，在其病毒颗粒内部还包含有tRNA引物分子、反转录酶、RNaseH和整合酶等组分。 * 迄今已经在鸟类及哺乳类动物中发现了许多种反转录病毒。例如鸟类的脾坏死病毒(SNV)、鼠类的乳腺肿瘤病毒(MMTV)，莫洛尼氏小鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMLV)等等。 其中研究得最为详尽的则要数劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)。RSV病毒感染了鸡之后，就会诱发产生肿瘤。从感染细胞中分离出来的反转录病毒的DNA，是一种有用的动物细胞的基因载体。 * 反转录病毒家族可以分成三种不同的类群： ※泡沫病毒(foamy viruses)类群，例如人泡沫病毒(HFV)； ※慢病毒(Lentiviruses)类群，例如人免疫缺损病毒(HIV)I型和Ⅱ型，以及绵羊髓鞘脱落病毒(Visna virus)等； ※致癌病毒(onco viruses)类群。并非所有本类群的病毒都是致癌的。根据在电子显微镜下观察的病毒颗粒的形态学特征的差异，致癌病毒类群又可区分成A、B、C、D四个类型。 * 反转录病毒作为动物基因克隆载体的优点： 第一，在大多数情况下，反转录病毒的肿瘤基因(oncogene，onc)都能够在正常的细胞中转录。 第二，反转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物和脊椎动物。其中有的还能够在人体细胞中生长。当两种不同的反转录病毒在同一寄主细胞中生长时，就会出现一种DNA被另一种外壳蛋白质包装成假型病毒的奇特现象。由于病毒的寄主范围实质上是由其蛋白质外壳决定的，因此使用这种假型病毒便有可能将某些病毒基因组导入正常无法感染的细胞，从而进一步扩大寄主范围。 * 第三，反转录病毒具有强启动子，克隆于此类载体上的外源基因有可能得到有效的表达。有些反转录病毒，例如鼠乳腺肿瘤病毒，其启动子的活性功能的开启或关闭可以通过实验手段予以控制。 第四，反转录病毒不但感染效率高，而且通常还不会招致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和形成感染性病毒颗粒的能力。因此，有可能利用反转录病毒作载体，改变动物细胞的基因型，并可遗传到子代细胞。 * (三）其它的病毒载体 痘苗病毒(Vaccinia virus)具有双链DNA基因组，同天花的病原体天花病毒(Variola virus)的亲缘关系十分密切。当人们接种了痘苗病毒之后，便可获得对天花的高度免疫性。在DNA重组技术发展之后不久，就有人将外源DNA片段插入到痘苗病毒的基因组中，得到了具有生物活性的重组病毒。根据这一发现，基因工程学家便设想构建能够表达多种病原体抗原的重组痘苗病毒，作为预防这些病原体感染的活疫苗。 1、痘苗病毒载体 * 乳头瘤病毒(Papilloma viruses)能够感染包括人类在内的多种脊椎动物，产生上皮肿瘤，例如肉疣和乳头瘤。已有研究表明，人乳头瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)能够诱发人宫颈癌(human cervical carcinoma)。可见，此类病毒与人类的关系十分密切。但是只有完全分化的扁平的上皮细胞(epithelial cell)，才能产生感染性的乳头瘤病毒，迄今为止还没有办法在培养的细胞中增殖这种病毒。 2．乳头瘤病毒载体 * 目前对于乳头瘤病毒的分子生物学研究，远远地落后于其它病毒。然而有几种乳头瘤病毒的DNA能够转化培养的细胞，而且在转化的细胞内，病毒的基因组保持游离的多拷贝的状态，每个分离后的细胞可达50一200份。利用乳头瘤病毒基因组这种非整合的特性，克隆在它上面的外源基因的复制与表达，则可免受染色体的控制，而得到大量的扩增，同时又不会导致寄主细胞的裂解死亡。从这点考虑，乳头瘤病毒载体比上面所讨论的整合性载体具有突出的优点，因而在近年很受人们的关注。 * ※ 腺病毒(Adenoviruses)是一群无囊膜的20面体的病毒，所含的双链DNA的分子大小约为36kb。 3．腺病毒载体 ※ 腺病毒具有很大的发展为真核基因的表达体系潜力。这首先是因为它的基因组DNA分子量大，可插入较大的外源DNA片段，而且还可以在寄主细胞中大量地增殖。其次，在腺病毒感染周期中，寄主蛋白质合成被关闭掉了，因此能最大限度地合成病毒编码的蛋白质，这种特性为克隆基因蛋白质产物的检测与纯化提供了很大的方便。 * ※ 构建腺病毒载体的重要步骤是，设法减少其基因组DNA中某些核酸内切限制酶的切割位点的数目。 腺病毒载体的构建 ※ 在腺病毒载体的构建过程中，失去某种限制