犬猫血清中狂犬病抗体的测定酶联免疫吸附法.doc.doc

犬猫血清中狂犬病抗体的测定　酶联免疫吸附法 1　范围 本标准规定了犬猫血清中狂犬病免疫抗体的测定方法。 本标准适用于接种狂犬病疫苗的犬猫血清中狂犬病免疫抗体的定性检测。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 3　原理 向包被有狂犬病病毒抗原的酶标板中加入犬猫血清，犬猫血清中的狂犬病抗体与酶标板中的抗原相结合，然后加入酶标记物，酶标记物与酶标板上的抗原抗体结合物形成复合物，最后加入底物，底物与酶标记物反应形成有颜色的化合物，终止反应后，用酶标仪测量其OD值，通过阳性质控的OD值确定犬猫血清中有无狂犬病免疫抗体。 4　仪器与设备 4.1　酶标仪：内置450 nm和630 nm滤光片。 4.2　多道移液器：（50～300）μL。 4.3　单道移液器：（5～50）μL，（10～200）μL，（100～1000）μL。 4.4　恒温培养箱。 4.5　振荡混匀器。 5　试剂与材料 犬猫狂犬病免疫抗体ELISA检测试剂盒：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录 A。实验用水应符合GB/T 6682的规定。 6　操作程序 6.1　质控分布与稀释 用单道移液器向A1，A2，B1，B2酶标板微孔里各加90μL样品稀释液，分别向A1，A2孔里加10μL阴性质控，向B1，B2孔里加10μL阳性质控，使质控的稀释比例为1：10。 6.2　样品的预稀释 向每个血清稀释板微孔里各加入90μL样品稀释液，然后分别加入10μL待检血清，使样品预稀释液的稀释比例为1：10。 6.3　样品的分布与稀释 向剩余每个酶标板微孔里加入90 μL样品稀释液，然后分别加入10 μL样品预稀释液，用振荡混匀器充分混匀后，用封口膜封好，使样品最终稀释比例为1：100。 6.4　孵育 （37±1）℃ 孵育（60±5）min。 6.5　洗液的配制 按1：10的比例，用实验用水稀释浓缩洗涤液。 6.6　洗板 取掉封口膜，先甩去酶标板微孔里的液体，然后用多道移液器向每个酶标板微孔里加入300μL洗液，每次浸泡30s，再弃去洗液，先后洗涤5次，最后在吸水纸上拍干。 6.7　加酶标记物 按1：10的比例，用酶标记物稀释液稀释酶标记物后，向每个酶标板微孔里加入100μL稀释好的酶标记物，用振荡混匀器充分混匀后，用封口膜封好。　 6.8　孵育 同本标准6.4。 6.9　洗板 同本标准6.6。 6.10　底物反应 向每个酶标板微孔里加入100μL过氧化物酶底物，室温（20～25）℃，避光孵育（30±5）min。 6.11　终止反应 向每个酶标板微孔里加入50μL终止液，轻轻摇动酶标板使之混匀，使孔内无气泡。 6.12　测量OD值 用酶标仪在双波长450nm和630nm，或者单波长450nm下测量OD值。 7　检测有效性及结果判定 7.1　当阳性质控OD值≥0.300，并且当阴性质控OD值 0.5×阳性质控OD值时，实验结果成立。 7.2　样品的OD值≥阳性OD值，则可判定为狂犬病免疫抗体阳性。  附录(10×浓度) 用酶标记物稀释液10倍稀释，24 h内用完。 3 过氧化物酶底物 直接使用。 4 阴性质控(10×浓度) 稀释后24 h内用完。 5 阳性质控(10×浓度) 稀释后24 h内用完。 6 样品稀释液 直接使用。 7 洗涤液(10×浓度) 稀释后48 h内用完。 8 酶标记物稀释液 直接使用。 9 终止液 直接使用。 A.2　注意事项 A.2.1　使用前所有的试剂应在（18～25）℃回温2 h。 A.2.2　将所有的试剂和样品作为危险生物品处理。 A.2.3　应避免皮肤和眼睛接触试剂。如有接触，立即用冷水冲洗接触处。 A.2.4　在样品采集、储存和转运中应避免污染，每个样品应使用不同的吸头。 A.2.5　所有试剂应在（3～5）℃保存，并在有效期内使用。 DB43/T 1076—2015 DB43/T 1076—2015 2 1