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动物细胞重组技术与克隆技术 动物细胞重组技术与克隆技术 第一节 细胞重组技术的概论 第二节 细胞重组技术的重要应用——克隆技术 第一节 细胞重组技术的概论 一. 细胞重组技术的定义 细胞重组技术又被称为细胞拆合技术，就是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞的一种实验技术过程。 细胞的生长过程包含着细胞器的自我装配，这是一种活体的自我装配，而细胞重组则是离体的装配过程。 真核细胞的细胞核和细胞质相互配套、精确平衡。 二. 细胞重组的基本方式 一般而言，细胞重组的方式基本分为以下三种 胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种细胞 胞质体与核体重新组合形成重组细胞 微细胞（微核体）与完整细胞重组形成微细胞异核体 其中，第2种方式是最为重要的细胞重组技术 三. 细胞重组的技术基础 细胞操作技术（细胞分离技术1；细胞核质分离技术2） 动物细胞融合技术3 （有膜细胞成分的融合重组） 显微操作技术4（细胞内物质的抽取和移植；物质向细胞的注入） 原理 操作时，先配制一定浓度的梯度介质，然后加入细胞溶液中，在选定得离心力作用下，不同密度的细胞处于离心介质的密度范围内或向下沉降，或向上漂浮，当移动至其密度与介质密度相等的位置（等密度点）便不再移动，形成静止区带，即达到离心平衡，各组分按密度不同处于区带的不同位置，然后，这些不同位置的细胞分开收集，就能达到彼此分离的目的离心技术。 密度梯度介质 梯度介质具有足够大的溶解度，以形成所需的密度浓度范围；不会与样品中的组分发生反应；也不会引起样品中组分的凝集、变形或失活。 氯化铯（CsCl）和Ficoll（多聚蔗糖）等。 [实例] 用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC） Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，疏水性高，平均分子量为400，000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。 常用来分离人PBMC的分层液比重是 1.077±0.001 的 聚蔗糖-泛影葡胺分层液。 红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 流式细胞仪及其分选细胞原理 主要由4部分组成：①细胞流动系统及气压流速控制系统，②激光系统，③检测与讯号处理系统，④细胞分选系统。 其主要原理是细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。 当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴，每小滴内最多含一个细胞； 细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型； 如识别的是预计所需的细胞时（如T细胞、B细胞要其亚群），在细胞样品流断裂成小滴时，使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷，使所需的细胞在电场偏转下进入不同的收集管； 用FACS分离细胞准确快速，能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行，但仪器昂贵，极少用于常规，而多数仅作为研究的手段。 四. 三种细胞重组基本方法的实践意义 A.胞质杂种 胞质杂种细胞是不同种系之间的一种真正的新型细胞，在适宜的条件下能成功的生存下去，它在物种的品种改良、医学及农业的各个方面将产生重大的影响； 胞质杂种细胞对于研究去核细胞质体的作用具有重要的意义。 B.微细胞异核体 微细胞异核体的制备提供了一种新颖有效的基因转移技术，被称为微细胞见到的基因转移法； 微细胞导入的基因只有一条或若干条染色体，能够提高异核体的基因组整合效率，并且能够用于研究供体的特定基因功能； C.重组细胞 能够完整无性杂交、能过实现生物体的无性繁殖； 是一种最为重要的细胞重组技术。 五. 细胞重组技术的价值 细胞重组技术是现代生物工程中令人瞩目的热点课题之一 细胞重组技术将细胞融合技术和胞质分离等技术相结合，为重新构建不同类型的杂种细胞提供了可能； 细胞重组技术使动物无性繁殖成为可能； 细胞重组技术结合基因转移技术可以人为地使细胞表达新性状和产生新产物； 细胞器重建技术对于揭示细胞生命活动的规律具有重要的意义。 第二节 动物细胞重组技术的重要应用——动物克隆技术 一. 什么是克隆？ “克隆（clone）”一词来源于希腊语，原意是用于扦插的枝条，也就是指无性繁殖。本意是遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体； 最初是指在微生物实验中，通过平板培养所获得的一个个菌落（细菌克隆）； 随着分子生物学的发展，随着基因工程与核移植技术的出现；现在，克隆一词已不再指一般意义上的无