生物技术制药课程-生物技术在传统制药中的应用邹祥.pptVIP

主要内容 基因工程在传统生物制药工业生产中的应用 克隆抗生素生物合成基因的策略和方法 生物技术在抗生素生产上的应用 提高抗生素产量 改善抗生素组分 改进抗生素生产工艺 产生杂合抗生素 1.传统生物制药工业的特点 产业规模大 2007年我国抗生素原料销售收入350多亿元，我国抗生素原料药产能、产量居世界首位 产能过万吨产品：青霉素、头孢菌素、红霉素 中国已经成为氨基酸生产和消费大国, 年消费量约 140 万t左右 维生素现已成为国际医药与保健品市场的主要大宗产品之一，每年维生素市值已达25亿美元，我国年产能力约20万t 传统育种方法与现代生物技术在制药工业中的比较 传统的育种方法: 要用经典的方法育种 盲目性高 不能组合不同菌株的优良性状 现代生物技术: 基因重组改造菌种 提高产品产量 改造传统的发酵生产工艺,节约能源和原料,降低污染 诱变育种 采用诱变因子促使微生物遗传物质发生改变，从而导致其性能改善到菌种优化方法 物理诱变因子 紫外线、射线 化学诱变剂 化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等 现代生物技术：理性化育种 建立在微生物生理代谢理论和抗生素合成机理基础上，有目的调节产生菌生理代谢、调节生物合成途径或改造其生物合成基因结构到育种。 链霉菌为主到次级代谢产物产生菌到基因克隆表达宿主系统日益完善 新观点：系统代谢工程改造菌种 Park JH, et al. Current Opinion in Biotechnology,2008,19:454-460 大量引进国外高产菌株 我国至今用于大规摸工业生产的生产菌株，如青霉素、红霉素、头C、各种氨基酸、阿维霉素、泰乐霉素、黄霉素以及高表达水平的基因工程产品等几乎都是从国外高价引进。因此，从根本意义上来说，我国的传统生物制药工业和现代生物技术产业缺乏竞争力。 现代生物技术改造传统制药工业 抗生素 提高产量和改善组分 产生新的杂合抗生素 现代生物技术改造传统制药工业 氨基酸 获得高产菌种 缬氨酸 组氨酸 苏氨酸 异亮氨酸 现代生物技术改造传统制药工业 维生素: 获得高产菌种 简化生产工艺 2.背 景 20世纪70年代,重组DNA技术兴起应用于医药蛋白多肽方面,取得了突出的效果. 80年代,重组DNA技术应用于结构比较复杂的次级代谢产物的生物合成.(链霉菌) 目前,抗生素生物合成酶基因的分离 ,质粒的选择,基因重组于转移和宿主表达.(已克隆的抗生素合成基因有23种之多) 抗生素基因簇的组成 克隆抗生素生物基因的策略和方法 在标准宿主系统中克隆检测单基因产物 阻断变株法 突变克隆法 直接克隆法 克隆抗生素抗性基因法 寡核苷酸探针法 同源基因杂交法 在标准宿主系统中克隆检测单基因产物 鸟枪克隆法 把抗生素产生菌的DNA克隆到最常用的宿主——变青链霉菌中，通过检测宿主中的个别基因产物，筛选克隆，从而分离基因。 PABA合成酶基因——pab的克隆 阻断变株法 阻断变株法 通过一系列阻断变株的互补结果来确定被克隆的DNA片断的性质 方法与步骤 野生型 突变型 筛选表型恢复型 分析基因 总DNA 基因库 Tetracenomycin C (tam C) Tetracenomycin C(丁省霉素) 是一个有淡青链霉菌产生的抗生素 分离tamC—的突变株 并 分析阻断性质 野生型总DNA BamH1消化 连接到pIJ702 突变克隆法 直接克隆法 直接克隆法 直接克隆整套的生物合成基因（适合于基因簇相对较小（30kb）的抗生素生物合成基因。 局限：大片段基因簇的稳定性、原始株的重要的调控因素 头霉素C基因的克隆 根据抗生素生物合成基因和抗性基因是连锁的，表达上也是协同的，而且抗性基因比较小（1-2kb），容易检测和克隆。 红霉素生物合成基因的克隆 寡核苷酸探针法 事实基础 链霉菌基因对密码子的利用有明显的不随机性，即DNA中G+C的比例为70%以上，密码子第三位有90%以上为G或C 原理 分离抗生素生物合成酶后，获得这些酶的氨基酸序列，根据氨基酸序列推倒出较低程度简并性的基因序列，人工合成寡核苷酸探针，从基因文库中就可克隆生物合成基因 同源基因杂交法 原理 利用一种已克隆的抗生素生物合成基因片段为探针，探测相关抗生素同源基因，最后分离及克隆抗生素生物合成基因 由于基因保守序列的同源性，利用同源基