siRNA干扰SIAH对细胞活性和α―synuclein泛素化降解通路的影响.docVIP

siRNA干扰SIAH对细胞活性和α―synuclein泛素化降解通路的影响 　　【摘要】 目的：研究siRNA干扰SIAH基因对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞α-synuclein泛素化、降解通路的影响。方法：用荧光标记的siRNA-FAM转染SH-SY5Y细胞后，专业设计合成3条针对SIAH的siRNA，Western Blot检测蛋白水平SIAH表达的变化，筛选出其中最高效的1条siRNA，用CCK-8法检测该siRNA-SIAH干扰SH-SY5Y细胞活性；流式细胞技术检测该siRNA-SIAH干扰SH-SY5Y细胞凋亡的影响；Western Blot检测α-synuclein、LC3、E1、P53蛋白水平表达的变化；qRT-PCR检测SIAH、α-synuclein、LC3、E1 mRNA水平表达的变化；免疫共聚焦分别检测SIAH、α-synuclein、LC3共定位情况。结果：3条siRNA均成功转染SH-SY5Y细胞，流式细胞术检测siRNA转染SH-SY5Y细胞转染率89%，Western结果显示其中siRNA-2#使细胞中SIAH蛋白表达明显降低，选取该序列进行研究。CCK-8法结果显示该siRNA干扰SIAH后对SH-SY5Y细胞活增高，流式细胞技术检测结果显示该siRNA干扰SIAH可抑制SH-SY5Y细胞的凋亡，与空白对照组、阴性对照组比较，差异均有统计学意义（P 　　【Key words】 Parkinsons disease； Seven in absentia homolog（SIAH）； α-synuclein； Ubiquitin-proteasome system 帕金森病（Parkinsons Dieaese，PD）是阿尔茨海默病后的第二大最常见的神经系统变性疾病，65岁以上的发病率约1%[1]。它的特点是黑质致密部及其他脑干区域多巴胺能神经元变性和丢失，其主要临床表现为静止性震颤，运动徐缓、强直、姿势不稳定以及其他各种运动和非运动功能[2-3]。不管家族性或散发的帕金森病，其主要病理学标志是以胞质内α-synuclei聚集物为主的路易小体形成[4]。E3泛素连接酶―SIAH（seven in absentia homolog）能够使α-synuclein中的赖氨酸单泛素化，并能够促进其聚集而发挥对细胞的毒性作用[5]。本研究采用siRNA技术干扰SH-SY5Y细胞的SIAH活性，从而抑制α-synuclein的单泛素化，阻止细胞的死亡，为PD的靶向治疗寻找有效的调控靶位，提供新的治疗方法 1 材料与方法 1.1 材料 SH-SY5Y细胞为苏州大学神经科学研究所惠赠，胎牛血清购自Hyclone有限公司，DMEM/F12购自Gibco公司、LipofectamineTM2000购自上海Invitrogen公司，CellCountingKit-8（CCK-8）购自Dojindo公司，TRNzol试剂、逆转录试剂盒购自Takala公司，引物由英俊科技有限公司设计合成，蛋白上样缓冲液（5X）购自碧云天生物技术研究所，BCA蛋白定量试剂盒购自美国Bioworde公司，Marker购自Thermo公司 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 含血清浓度10%的DMEM/F12培养基培养SH-SY5Y细胞，细胞培养于6 cm细胞培养皿中。每2～3天用0.1%的胰酶消化将细胞传代，细胞换液时加入培养液3 mL/次，培养皿放置于温度37 ℃、二氧化碳（CO2）浓度为5%的孵箱中培养 1.2.2 SIAHsiRNA的设计合成 由苏州吉凯公司设计合成SIAH基因的3条siRNA，siRNA1、siRNA2和siRNA3。序列分别为siRNA1序列：5-GCUCACAUGUUGUCCAACUTT-3’，其Anti-sense为5-AGUUGGACAACAUGUGAGCTT-3’；siRNA2序列：5-CCUGGUGCUUCCUGUAAAUTT-3’，Antisense为5-AUUUACAGGAAGCACCAGGTT-3’；siRNA3序列为5-GCGACUGUCUAGUCUUUGATT-3’，其Anti-sense为5-UCAAAGACUAGACAGUCGCTT-3’ 1.2.3 实验分组与细胞转染处理 实验分空白对照组（即未处理细胞组）、siRNA干扰组（siRNA-1#组、siRNA-2#组和siRNA-3#组）和阴性对照组，转染操作按照Invitrogen公司LipofectamineTM2000说明书进行 1.2.4 CCK-8法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后细胞活性 将细胞铺板96孔板，按照上述步骤进行转染，置于37 ℃、饱和湿度、5%的CO2条件下