第十二章机体免疫功能的检测技术.pptVIP

第九章 机体免疫功能的检测技术 第一节 免疫细胞的分离与纯化 第二节 体液免疫功能的检测 第三节 细胞免疫功能的检测 第四节 细胞因子及其受体的 　　　 检测技术 第一节 免疫细胞的分离与纯化 一、白细胞的分离 二、外周血单个核细胞的分离 三、淋巴细胞及其亚群的分离 四、其他细胞的分离和收集 1．自然沉降分离法 2．聚合物加速沉淀法 上层：淡黄色血浆 灰白层：白细胞 底层：红细胞 1. Ficoll分层液法 2. Percoll分层液法 ◆ Ficoll分层液法即聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度离心分离法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation) ◆ 聚蔗糖密度：1.020 泛影葡胺密度：1.200 ◆ 外周血单个核细胞（PBMC）密度： 人：1.077 小鼠：1.088 马：1.090 单相免疫扩散试验 双相免疫扩散试验 双相免疫扩散试验 （3）火箭电泳 返回 返回 乳酸脱氢酶（LDH）释放法 CTL+靶细胞 释放LDH 碘硝基氯化四氮唑（INT） 红色甲臜（farmazan） 比活性测定（OD值） 杀伤率（%）= 实验孔OD值-自发释放孔OD值 最大释放孔OD值-自发释放孔OD值 ×100 靶细胞 细胞凋亡检测 杀伤率%=（靶细胞对照孔细胞数-共培养孔靶细胞数）/ 靶细胞对照孔细胞数×100% 效应细胞+靶细胞 细胞凋亡检测法 返回 三、其他免疫细胞功能的检测 1. 巨噬细胞功能的检测 3. NK细胞和LAK细胞功能的检测 返回 2. 嗜中性粒细胞功能的检测 1. 巨噬细胞功能的检测 炭粒廓清试验 吞噬功能的检测 巨噬细胞表面受体的检测 第二节 体液免疫功能的检测 一、免疫球蛋白的定量检测 二、B细胞数目及功能的检测 返回 一、免疫球蛋白的定量检测 返回 （1）单相免疫扩散试验 （2）双相免疫扩散试验 （3）火箭电泳 （4）中和反应 （5）ELISA 返回 FLASH 返回 FLASH 返回 血清抗体 病毒 接种细胞或鸡胚 计算半数保护率（PD50） （4）中和反应 返回 返回 二、B细胞数目及功能的检测 1. 外周血B细胞数目的检测 2. 外周血B细胞功能的检测 返回 1. 外周血B细胞数目的检测 ◆ 免疫荧光技术 ◆ 花环试验 返回 荧光显微镜 返回 CD19 CD3 流式细胞仪 B细胞EA、EAC玫瑰花环形成示意图 返回 2. 外周血B细胞功能的检测 ◆ B细胞非特异性增殖 ◆ 抗体产生能力 返回 返回 B细胞+刺激物（PWM，LPS） 溶血空斑试验 酶联免疫斑点试验 返回 第三节 细胞免疫功能的检测 一、T细胞亚群和数目的检测 二、T细胞功能的检测 三、其他免疫细胞功能的检测 返回 一、T细胞亚群和数目的检测 2. 免疫荧光技术 1. 花环试验 3. 免疫酶细胞技术 返回 返回 玫瑰花环试验 正常范围:60-80% E-花环形成率 = 形成花环的淋巴细胞数 淋巴细胞总数(形成和未形成花环的细胞总数) 荧光显微镜 返回 流式细胞仪 二、T细胞功能的检测 （一）体外功能实验 （二）体内功能实验 返回 （一）体外功能实验 1. 淋巴细胞增殖试验 2. 细胞毒试验 返回 51Cr释放法 乳酸脱氢酶释放法 细胞凋亡检测法 1. 淋巴细胞增殖试验 非特异性刺激物 （PHA、ConA） 特异性刺激物 （抗原） 3H-TdR掺入法 MTT法 形态学计数法 形态学计数法 转化细胞：体积大，染色质疏松呈细网状，核/细胞比例变小 未转化细胞：体积小，核染色体致密，核/细胞比例大 转化率=转化细胞数/淋巴细胞总数 评价标准：60-80%为正常， 50-59%为偏低， 50%为降低 淋巴细胞 + 刺激物 培养56h 加入3H-TdR 24h后收集细胞于玻璃纤维滤膜 液闪仪测定放射性(cpm) 刺激指数(SI)=刺激孔cpm/对照孔cpm 3H-TdR掺入法 正常值 SI2 MTT法 [3-4,4-二甲基噻唑－2]，5－二苯基四氮唑溴盐，简称MTT； 线粒体的琥珀酸脱氢酶将MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，经盐酸—异丙醇溶解后为蓝色溶液； 比色测定间接反映活细胞数量。 返回 刺激指数(SI)=刺激孔OD值/对照孔OD值 51Cr释放法 杀伤率（%）= 实验孔cpm-自发释放孔cpm 最大释放孔cpm-自发释放孔cpm ×100 * * wzjiang@bio.ecnu.edu.cn(O) (M) 江文正 第九章　机体免疫功能的检测技术 返回 返回 一、白细胞的分离 血液中红细