第6节蛋白质的性质与分离2学时.ppt

第五节 蛋白质性质 1、蛋白质分子大小 2、两性解离与蛋白质的等电点 3 、蛋白质的胶体性质 4、蛋白质的沉淀 5、蛋白质的变性 6、蛋白质的颜色反应 1、蛋白质分子大小 6000~1 000 000 根据化学组成测定最低相对分子量 渗透压法测定相对分子量 蛋白质的扩散和扩散系数 沉降分析法测定相对分子质量 凝胶过滤法测定相对分子质量 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 渗透压法测定相对分子量＿ 沉降分析法测定相对分子质量＿制备型超速离心机 分析型超速离心机 凝胶过滤法测定相对分子质量 2、两性解离与蛋白质的等电点（常见解离基团） 氨基酸侧链上的可解离基团 （1）解离后带有正电荷的基团 赖氨酸残基的ε－氨基;精氨酸残基上的胍基;组氨酸残基上的咪唑基 （2）解离后带有负电荷的基团 谷氨酸残基上的γ－羧基;天冬氨酸残基的β－羧基 另外还有其它的可解离基团:丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的羟基,半光氨酸的巯基 蛋白质的等电点 当蛋白质处于某一pH值溶液中时，蛋白质所带的正负电荷相等，净电荷为0，此时溶液的pH值为蛋白质的等电点。 等电点是蛋白质的特征常数；各种蛋白质有各自的等电点 3、蛋白质的胶体性质P299 蛋白质胶体溶液稳定的因素 1～100nm， 同种电荷; 水化层(溶剂化层) 不能通过半透膜 透析 超过滤 4、蛋白质的沉淀反应P300 （1）盐析法：中性盐（硫酸铵，氯化钠等），脱水化层。 （2）有机溶剂沉淀法：甲醇、已醇、丙酮等，脱水化层。 （3）重金属盐沉淀法：Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+不溶性盐沉淀 (4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂 (5)加热变性沉淀法 5、蛋白质的变性（denaturation） (P233) (1)概念 天然蛋白质分子受到某些物理因素如热、紫外线等或化学因素如有机溶剂、脲、胍、酸、碱等的影响时，生物活性丧失，溶解度降低，不对性增高以及其他的理化常数发生改变，这种过程称为蛋白质的变性 实质：次级键被破坏，一级结构保持完好。 （2）变性的表现 ①生物活性丧失：酶、激素、毒素等 ②一些侧链基团暴露 ③一些物理化学性质的改变：溶解度降低，分子形状改变，不对称程度增高，粘度增加、扩散系数降低。 ④生物化学性质的改变 我国化学家吴宪20世纪30年代提出变性学说 （3）蛋白质变性的理化因素： ①物理因素： 　加热、激烈振荡、超声波、 χ-射线、紫外线等； ②化学因素： 　 酸、碱、 乙醇、丙酮等有机溶剂、尿素、盐酸胍、某些去垢剂(SDS)等 （4）蛋白质的复性 当变性因素除去后，变性蛋白质又可重新回复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性。 第6节 蛋白质分离纯化 1、一般原则 前处理（pretreatment） 把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，保持天然状态。 粗分级分离（rough fractionation） 将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。 细分级分离（fine fractionation）：样品的纯化。 2、蛋白质的分离纯化方法 分子大小 溶解度; 电荷; 吸附性质; 对配体分子的生物学亲和力 2.1根据分子大小不同的纯化方法 （1) 透析和超过滤 （2) 密度梯度离心 （3) 凝胶过滤法 透析 超过滤 2）密度梯度离心 （3）凝胶过滤 凝胶过滤又称为凝胶过滤层析或分子排阻层析，是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。 凝胶过滤所用的介质是凝胶珠或称凝胶颗粒，其内部是多孔的网状结构。 当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。 这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。 凝胶过滤法图示 2.2利用溶解度差别的纯化方法 （1) 等电点沉淀和PH控制 （2) 蛋白质的盐溶和盐析 （3) 有机溶剂分级分离法 （4) 温度对蛋白质溶解度的影响 2.3根据电荷不同的纯化方法 2.3.1 电泳: 2.3.2 离子交换层析 (1)概念 所谓电泳是指带粒子在电场中向与其电性相反的的电极移动的现象。 电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋白质、核苷酸和核酸等生物分子的分离分析和制备。 带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。 (2)原理 颗粒在电场中发生泳动时，受到两种方向相反的力的作用： F（电场力）=qE(qU/S)； Ff(摩擦力)=fv 其中q=颗粒所带的电量； E=电场强度或电势梯度=U/S； U=两电极间的电势差（以伏特表示）； S=